細胞外囊泡（EVs）作為各種疾病的生物標志物正迅速受到研究人員的青睞，其可以充當來源細胞的寶貴信息載體。然而，盡管細胞外囊泡具有重要價值，但其在臨床實踐中的應用仍然有限。在眾多限制因素中，最關鍵的因素之一是分離細胞外囊泡所面臨的挑戰(zhàn)。事實上，目前采用的主流細胞外囊泡分離方法存在分離純度低、通量小以及重現(xiàn)性差等問題。

據(jù)麥姆斯咨詢報道，為解決上述問題，近期，來自意大利帕多瓦大學（University of Padova）等機構的研究人員開發(fā)了一種液滴微流控平臺，該平臺能夠利用磁珠的免疫捕獲親和力，實現(xiàn)細胞外囊泡的高效分離。該平臺能夠在相對較短的時間內（4.5小時）處理大量樣品（2 mL），并且其自動化程度相當高。

此外，研究人員將基于液滴微流控平臺的細胞外囊泡分離方法與市售方法進行了比較，結果表明，基于液滴微流控平臺的細胞外囊泡分離方法所需的孵育時間更短（市售方法所需的孵育時間為其2.5倍），捕獲效率更高（其捕獲效率為市售方法的2.5倍）。相關研究成果以“Droplet microfluidic platform for extracellular vesicle isolation based on magnetic bead handling”為題發(fā)表在Sensors and Actuators B: Chemical期刊上。

具體而言，研究人員首先介紹了其開發(fā)的液滴微流控平臺。如圖1所示，為分離細胞外囊泡而開發(fā)的液滴微流控平臺由三個連續(xù)的自動化模塊組成：（1）液滴生成器；（2）液滴孵育器；（3）磁珠提取器。各模塊由注射器或壓力控制器控制。實驗開始前，將含有磁珠和細胞外囊泡的樣品先存放在一個搖動裝置中，以防止磁珠沉降。在通過雙T型接頭生成液滴的過程中，啟動注射器并將控制器的壓差（ΔP）設為零，同時保持閥門關閉，以便使液滴從出口5流出PDMS基微流控芯片（見圖1）。注入微流控芯片中的分散相和連續(xù)相的流速可以調節(jié)，以獲得所需大小的液滴。經過適當優(yōu)化后，最終將載體油、水性樣品和礦物油的流速分別設定為30 μL/min、250 μL/min和60 μL/min，從而生成體積為980 ± 60 nL的液滴。

用于分離細胞外囊泡的液滴微流控平臺及其工作流程示意圖

當所有的起始樣品都被分散生成液滴后，關閉注射器，打開閥門，并啟動壓力控制器，以控制液滴的運動。具體而言，通過交替施加正負壓差（50 ~ 200 mbar），在毛細管內進行的時長可調的孵育過程中，液滴會來回運動，從而促進其內容物的混合，并進一步增加細胞外囊泡與磁珠相遇和結合的幾率。

孵育結束后，閥門被再次關閉，利用與入口1連接的注射器將液滴引導至微流控平臺的第三個模塊——磁珠提取模塊中，以提取磁珠。在該模塊區(qū)域，將磁化金屬尖端靠近毛細管，從而可以在母液滴流動時從其中提取磁珠。一旦液滴完全從磁化金屬尖端前方通過，磁珠被完全捕獲，磁珠團便會被包裹在一個微小的液滴中。液滴最終的體積取決于磁珠的數(shù)量，通常，當磁珠的數(shù)量在10?到10?之間時，生成的液滴的體積在5 nL到50 nL之間。

隨后，將磁鐵從毛細管附近移開，磁珠會從毛細管中流出。將其收集到預裝入水溶液的常規(guī)PCR管中，用于隨后的細胞外囊泡分析。總而言之，只需將磁化金屬尖端從磁珠提取模塊區(qū)域移開幾毫米，使磁珠不再受到磁力作用，就能輕松完成磁珠的提取。

液滴內磁珠捕獲效率的表征

在后續(xù)的研究過程中，研究人員對開發(fā)的微流控平臺進行了表征，并展示了利用生物樣本對微流控平臺的性能進行驗證的結果。此外，通過蛋白質表征、細胞外囊泡定量和成像等手段，研究人員將基于液滴微流控平臺的細胞外囊泡分離方法與傳統(tǒng)的超速離心法和商業(yè)試劑盒方案進行了系統(tǒng)地比較。最后，研究人員還對分離出的細胞外囊泡的microRNA含量進行了評估。

液滴微流控平臺對不同起始樣品量（V = 50 ~ 2000 μL）的處理能力

液滴微流控平臺分離細胞外囊泡的性能驗證

綜上所述，在這項研究中，研究人員提出并驗證了一種基于液滴微流控技術和磁珠的新型平臺，并將其成功用于分離細胞外囊泡。值得注意的是，與使用市售方法相比，液滴微流控技術可以在更短的孵育時間內將捕獲效率提高2.5倍。此外，與單相微流控器件相比，該研究提出的微流控平臺在樣品量（最多2 mL起始樣品）和分析通量（超過400 μL/h）方面也有顯著提高。因此，可以認為，使用液滴微流控技術進行細胞外囊泡分離在基礎研究和臨床應用方面都具有巨大潛力。不過，對于臨床樣本（如血漿或血清）的處理，可能需要對表面活性劑進行專門優(yōu)化，以確保液滴的穩(wěn)定性，同時還需要對用于免疫捕獲的磁珠涂層進行優(yōu)化。

論文鏈接：
https://doi.org/10.1016/j.snb.2024.135583

審核編輯：劉清