微小RNA（miRNA）是一種約有19至24個(gè)核苷酸的非編碼RNA，具有高度保守性、時(shí)序性和組織特異性。miRNA廣泛存在于各種真核細(xì)胞中，作為基因表達(dá)的重要內(nèi)源性調(diào)控因子，與某些疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。有研究表明，乳腺癌、肺癌、前列腺癌等癌癥的共同特征是miRNA的異常表達(dá)。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，miRNA可以作為一種非侵入性的血液、尿液、唾液分析的生物標(biāo)志物，在疾病早期篩查與診斷等領(lǐng)域中具有較大應(yīng)用潛力。

然而，由于miRNA序列較短，而且各種miRNA之間相似度非常高，這些特點(diǎn)對(duì)檢測(cè)方法的適用性和特異性提出了要求。再加上檢測(cè)過(guò)程中復(fù)雜樣品的蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的干擾，使得miRNA的檢測(cè)并不容易。現(xiàn)有的檢測(cè)方法通常需要復(fù)雜的程序來(lái)分離、提取和富集miRNA，常常依賴于昂貴的設(shè)備和訓(xùn)練有素的操作人員。這些要求限制了現(xiàn)有方法在資源有限的環(huán)境下對(duì)復(fù)雜生物樣本的分析應(yīng)用。因此，開發(fā)一種操作便捷、成本低廉且可靈敏檢測(cè)復(fù)雜樣本中的miRNA的方法，有助于降低miRNA檢測(cè)實(shí)驗(yàn)對(duì)于環(huán)境、人員等的高要求，拓展miRNA檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)場(chǎng)所。

近日，首都師范大學(xué)張璐團(tuán)隊(duì)基于微流控可控組裝技術(shù)，設(shè)計(jì)制備出了一種探針鎖定-解鎖可轉(zhuǎn)換系統(tǒng)并將其應(yīng)用于無(wú)標(biāo)記miRNA檢測(cè)中，實(shí)現(xiàn)了miRNA的低成本、高靈敏度檢測(cè)。該論文以“Label-free microRNA detection using a locked-to-unlocked transforming system assembled by microfluidics”為題，發(fā)表在Lab on a chip期刊上。

具體而言，研究人員利用微流控技術(shù)高效合成了探針鎖定-解鎖可轉(zhuǎn)換系統(tǒng)，該系統(tǒng)的核心成員是DNA序列（G4m）與鏈霉親和素磁珠（MBs）的復(fù)合物，簡(jiǎn)稱為MBs-G4m。G4m的序列包含miRNA識(shí)別序列和富含鳥嘌呤的富G序列。G4m的兩端修飾了生物素，MBs的表面修飾了鏈霉親和素，使用微流控技術(shù)將兩者通入微通道內(nèi)進(jìn)行可控結(jié)合。

經(jīng)過(guò)參數(shù)優(yōu)化，研究人員得到了G4m兩端均修飾在同一MBs表面上的復(fù)合物，即MBs-G4m。該復(fù)合物中的G4m兩端被固定，G4m中的富G序列無(wú)法自由折疊，使得體系處于探針鎖定系統(tǒng)。當(dāng)該體系遇到目標(biāo)miRNA時(shí)，MBs-G4m復(fù)合物中的miRNA識(shí)別序列會(huì)捕獲目標(biāo)miRNA，形成DNA/RNA雙鏈。

此時(shí)溶液中的雙特異性核酸酶發(fā)揮作用，將DNA/RNA雙鏈中的DNA（miRNA識(shí)別序列）降解，目標(biāo)miRNA會(huì)被釋放回溶液中進(jìn)行下一次循環(huán)。降解之后，MBs-G4m復(fù)合物進(jìn)入解鎖狀態(tài)，G4m的一端被釋放，富G序列可以自由折疊，從而完成了由鎖定到解鎖的轉(zhuǎn)換。

在解鎖狀態(tài)下，研究人員通過(guò)磁分離技術(shù)將MBs-G4m復(fù)合物從復(fù)雜樣本中分離出來(lái)。解鎖態(tài)復(fù)合物中的富G序列可以與血紅素組裝形成G-四鏈體/血紅素DNA酶。利用該DNA酶催化底物顯色的能力，將目標(biāo)miRNA的數(shù)量信息轉(zhuǎn)換成易于測(cè)定的吸光度信息，從而實(shí)現(xiàn)了血清等復(fù)雜樣本中miRNA的定量檢測(cè)（圖1）。

圖1 （a）探針鎖定-解鎖可轉(zhuǎn)換系統(tǒng)檢測(cè)miRNA原理圖；（b）檢測(cè)miRNA的顏色變化圖

綜上所述，研究人員利用微流控技術(shù)高效合成了探針鎖定-解鎖可轉(zhuǎn)換系統(tǒng)，只需2分鐘就可以制備出足夠的MBs-G4m復(fù)合物用于miRNA檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。該復(fù)合物擁有良好的磁響應(yīng)性和miRNA報(bào)告能力，可以通過(guò)磁分離減少?gòu)?fù)雜基質(zhì)中干擾組分對(duì)miRNA檢測(cè)的影響，實(shí)現(xiàn)復(fù)雜生物樣本中miRNA的準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便的定量分析。這種基于微流控技術(shù)快速合成探針的新檢測(cè)體系為在復(fù)雜基質(zhì)中靈敏且方便的檢測(cè)miRNA提供了一種新的思路。

審核編輯：劉清