熒光輔助的數(shù)字計數(shù)分析技術是指利用倒置熒光顯微鏡，可視化量化熒光探針數(shù)量，用于靶標定量檢測的一類技術。目前，已有包括有機染料、量子點、納米顆粒、微珠、DNA納米結構等多種熒光標記探針被報道。然而，這些探針普遍存在亮度低、尺寸小、制備工藝復雜等缺點，在實際應用中易導致檢測靈敏度低、成像設備要求高及重復性差等不足。工程化腫瘤細胞作為一種新型生物工具，現(xiàn)已成功應用于腫瘤治療、納米藥物遞送和納米材料合成等領域，這些工作為構筑熒光單細胞探針提供有利理論依據(jù)。

近期，廣西師范大學張亮亮、胡盛強課題組與安陽師范學院高鳳麗課題組合作提出使用功能化磁性納米顆粒來定性修飾熒光染色的腫瘤細胞，用于構筑磁性熒光單細胞探針。結合熒光輔助的數(shù)字計數(shù)策略，量化靶標依賴的結合或剪切事件，以期實現(xiàn)靶標靈敏、快速分析。相關成果以“Engineered Cancer Cells as Signal Probes for Fluorescence-Assisted DigitalCounting Analysis”為題發(fā)表在國際化學權威期刊Analytical Chemistry上。

在該項研究中，研究人員首先選擇適配體功能化的磁性納米粒子與熒光染色的腫瘤細胞共培養(yǎng)，初步嘗試磁性熒光單細胞探針構筑的可能性。細胞成像結果表明，微米級腫瘤細胞表面明顯覆蓋一層磁性納米粒子涂層，且細胞形貌保持不變，該結果有利證明熒光單細胞探針的成功構筑。不同于適配體與細胞膜蛋白特異性相互作用，基于細胞膜磷脂雙分子層結構的非選擇性親疏水作用也可為磁性熒光單細胞探針構筑提供另一種可能。除細胞膜表面天然受體外，選擇合適的化學修飾策略，在細胞表面引入人工受體，也可以用于構筑熒光單細胞探針。

圖1：（a）Fe?O? NPs的TEM圖；（b）Ramos細胞共聚焦圖；（c）熒光單細胞探針構筑示意圖；（d）明場、（e）Hoechst33342通道及（f）疊場單細胞探針熒光成像圖



圖2：（a）熒光單細胞探針的不同構筑策略；（b）同時構筑Fe?O?-Ramos和Fe?O?-CCRF-CEM熒光單細胞

隨后，研究人員利用所構筑的熒光單細胞探針構建熒光輔助的數(shù)碼計數(shù)平臺。作為概念驗證實驗，研究人員通過合理設計適配體序列，引入核酸外切酶III（Exo III）識別位點。通過可視化計算Exo III加入前后熒光單細胞探針數(shù)量，來量化靶標依賴的剪切事件，從而實現(xiàn)Exo III活性的間接數(shù)字檢測。此外，基于適配體的特異性識別與連接作用，研究人員選擇適配體功能化的磁性納米粒子來直接檢測腫瘤細胞。

圖3：（a）Exo III活性數(shù)碼計數(shù)分析示意圖；（b）瓊脂糖凝膠電泳圖；（c）不同濃度Exo III下Fe?O?-Ramos單細胞探針的共聚焦熒光顯微鏡圖像；（d）Fe?O?-Ramos單細胞探針數(shù)量與ExoIII濃度的關系曲線；（e）選擇性實驗圖

綜上所述，該研究開發(fā)了一種新穎的熒光輔助數(shù)字計數(shù)策略，用于高靈敏、選擇性分析。相較于傳統(tǒng)的熒光探針，熒光單細胞探針在數(shù)字計數(shù)分析方面具有以下優(yōu)勢：（1）明亮的熒光和大尺寸能夠對每個靶標結合事件做出高保真的響應；（2）多種細胞工程方法為合理設計單細胞探針提供了多種選擇；（3）可以實現(xiàn)腫瘤細胞的直接定量檢測；（4）具有多種靶標同時數(shù)字計數(shù)分析的潛力。

審核編輯：劉清