近期，北京理工大學(xué)研究人員開發(fā)了基于LAMP-CRISPR耦合滑動芯片和智能手機的miRNA檢測系統(tǒng)：“靈捕”。該系統(tǒng)在生物傳感器的基礎(chǔ)上，通過滑動芯片對檢測的各個環(huán)節(jié)進行集成，同時利用智能手機微信小程序?qū)崿F(xiàn)了可視化交互，以及現(xiàn)場快速即時檢測（point-of-care testing，POCT），可應(yīng)用于癌癥早篩。

“靈捕”系統(tǒng)示意圖

結(jié)直腸癌作為一種常見的消化道惡性腫瘤，具有較高的發(fā)病率和死亡率。隨著社會經(jīng)濟水平的提高及生活和飲食結(jié)構(gòu)的改變，我國結(jié)直腸癌總體發(fā)病率與死亡率呈現(xiàn)明顯上升趨勢。結(jié)直腸癌患者Ⅳ期5年生存率為8%，而Ⅰ期5年生存率可以達到87.9%，在患者早期完成結(jié)直腸癌的篩查具有十分重要的意義。

目前臨床采用的篩查方法有胃腸鏡檢查、低劑量CT篩查及糞便隱血試驗等，但仍存在臨床檢測成本較高，以及各類并發(fā)癥或機體損傷的問題，目前臨床普及性較高的癌癥早期篩查手段均具有一定的局限性，迫切需要一種高效、安全的篩查方法。

微小核糖核酸（miRNA）是在進化上保守的、由19~22個成熟核苷酸組成的小分子非編碼調(diào)節(jié)單鏈RNA序列。miRNA的功能涉及到各種生理病理過程，在癌癥及相關(guān)癌前病變的不同疾病階段以及不同的發(fā)病部位之間都存在較為顯著的表達差異，并且已有多種miRNA被證實是有效的癌癥早篩標志物，實現(xiàn)其檢測意義重大。

miRNA可作為多種癌癥的生物標志物 RT-qPCR核酸擴增技術(shù)，可以通過復(fù)雜的探針設(shè)計將較短的miRNA序列變成較長的靶標，但作為變溫擴增方法，需要大型且較為昂貴的熱循環(huán)儀，其在資源有限的環(huán)境中的應(yīng)用受限。在此基礎(chǔ)上，研究人員提出環(huán)介導(dǎo)等溫擴增法（LAMP）以提高序列特異性、簡化擴增系統(tǒng)、降低檢測設(shè)備的開發(fā)成本。此外，基于滑動芯片的微流控芯片，具有操作簡便、對操作人員要求不高、所需樣本量少和檢測成本低、微型化、 高效快捷以及容易與其他裝置集成等特點，因此，研究人員構(gòu)建了與LAMP結(jié)合的全集成滑動芯片。

與LAMP結(jié)合的全集成滑動芯片示意圖

目前，miRNA檢測存在用時較長、檢測成本較高、需要設(shè)備較多等問題。miRNA即時檢測（POCT，point-of-care testing）系統(tǒng)，則是一類能夠在采樣現(xiàn)場即刻進行分析、省去標本在實驗室檢測時的復(fù)雜處理程序、快速得到檢測結(jié)果的新方法?；诖耍芯咳藛T由滑動芯片以及智能手機共同構(gòu)建了更具環(huán)境部署性與信息關(guān)聯(lián)性的POCT系統(tǒng)，來實現(xiàn)方便、快捷的miRNA檢測。

“靈捕”系統(tǒng)設(shè)計總方案

“靈捕”系統(tǒng)的優(yōu)勢 生物傳感器的設(shè)計“靈捕”系統(tǒng)充分整合LAMP等溫擴增技術(shù)、CRISPR/Cas檢測技術(shù)、熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）等診斷學(xué)的新技術(shù)、新方法，通過LAMP實現(xiàn)miRNA的等溫擴增，采用CRISPR/Cas12a系統(tǒng)特異性識別擴增產(chǎn)物并輸出熒光信號，建立熒光強度與miRNA濃度的關(guān)系以實現(xiàn)定量檢測。

“靈捕”系統(tǒng)生物傳感器設(shè)計

基于生物檢測的硬件設(shè)計

研究人員設(shè)計了滑動芯片用以整合復(fù)雜的實驗室操作，既可以保持LAMP簡便、快捷、高效等優(yōu)點，又能以較少的試劑消耗實現(xiàn)檢測，在此基礎(chǔ)上構(gòu)建相應(yīng)的小型化設(shè)備以提供反應(yīng)溫度、檢測熒光結(jié)果。 軟件設(shè)計 “靈捕”系統(tǒng)還搭建了基于智能手機的小程序平臺，以實現(xiàn)對設(shè)備的控制及結(jié)果的可視化。使用者在使用時僅需按照微信小程序的操作提示進行加樣操作即可完成儀器的使用，可以將反應(yīng)主體部分拉出以進行反應(yīng)試劑加樣。

硬件和軟件設(shè)計

微信小程序示例圖 建模流程設(shè)計 建模部分以結(jié)直腸癌為癌癥代表，通過生物信息學(xué)方法，篩選結(jié)直腸癌相關(guān)miRNAs用于檢測方法開發(fā)中檢測對象的確定；并建立綜合風(fēng)險評分模型，基于檢測到的用戶樣本中多種miRNA的含量，綜合評價其患癌風(fēng)險。

建模流程設(shè)計

LAMP-CRISPR反應(yīng)的表征 研究人員首先驗證LAMP-CRISPR檢測miRNA的可行性，采用體系終濃度為5pM的miRNA-21進行LAMP引物連接反應(yīng)、LAMP擴增及CRISPR/Cas12a三步實驗，以證實這一檢測原理的可行性。無LAMP擴增反應(yīng)證明了LAMP擴增反應(yīng)的必要性：將miRNA轉(zhuǎn)換為CRISPR/Cas12體系可識別的雙鏈結(jié)構(gòu)，并對miRNA信號進行放大。

LAMP-CRISPR反應(yīng)的表征 LAMP-CRISPR/Cas體系用于miRNA的定量檢測 為了測試生物傳感系統(tǒng)對miRNA的檢出限，研究人員設(shè)置miRNA濃度梯度為500fM、50fM、5fM、0.5fM、0.05fM，構(gòu)建檢測標準曲線，結(jié)果表明miRNA的濃度與熒光強度具有線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)達93.13%，得出檢測的標準曲線LOD為0.069fM。

miRNA檢出限測定 硬件基礎(chǔ)及配套試劑優(yōu)化 為在滑動芯片上實現(xiàn)miRNA檢測試劑的預(yù)包埋，研究人員設(shè)計采用凍干珠替代LAMP試劑、CRISPR試劑，并實驗驗證可行性。在滑動芯片中進行單獨LAMP反應(yīng)和LAMP+CRISPR反應(yīng)，通過熒光顯微鏡觀測結(jié)果，發(fā)現(xiàn)滑動芯片和溫度控制模塊可以有效實現(xiàn)LAMP與CRISPR步驟，熒光檢測模塊經(jīng)測試可以正常使用。

熒光顯微鏡下LAMP和LAMP+CRISPR反應(yīng)結(jié)果觀察圖

溫度控制模塊和熒光檢測模塊 總體而言，研究人員構(gòu)建了LAMP-CRISPR技術(shù)耦合滑動芯片及智能手機的miRNA檢測系統(tǒng)：“靈捕”。檢測系統(tǒng)以miRNA作為癌癥早篩的生物檢測標志物，將LAMP等溫擴增與CRISPR/Cas12切割技術(shù)二者相結(jié)合，實現(xiàn)了對miRNA信號的高靈敏度擴增與識別。同時，研究人員通過滑動芯片實現(xiàn)了生物檢測體系的集成，并以此為基礎(chǔ)構(gòu)建了相應(yīng)的小型化設(shè)備以提供反應(yīng)溫度、檢測熒光結(jié)果。此外，研究人員建立了可支持生物傳感模塊與滑動芯片模塊的智能手機即時檢測操作系統(tǒng)，保證以可視化的形式呈現(xiàn)檢測結(jié)果、實現(xiàn)對設(shè)備的控制。

審核編輯 ：李倩