近日，國際癌癥研究機構（IARC）報告了全球最新癌癥數(shù)據(jù)：每新增 4 名癌癥患者，就有 1 名來自中國，每分鐘有將近 8 名中國人確診患癌。

對腫瘤患者來說，一旦腫瘤細胞出現(xiàn)特殊行為，細胞就有可能出現(xiàn)超強耐藥性，這時無論服用再昂貴的藥物，也可能是無濟于事。

研究發(fā)現(xiàn)，特定細胞的基因發(fā)生突變，往往是導致上述現(xiàn)象的主要原因。因此，在單細胞水平上，研究活細胞行為和基因突變的相關性，可幫助提供更精準可靠的臨床治療參考。

基于此，北京航空航天大學常凌乾課題組開發(fā)出一種新型單個活細胞水平研究平臺（Single Living Cell Analysis Nanoplatform，下稱 SLCA 平臺），借助納米電遞送技術，該平臺可將一種用于原位信號放大的多米諾熒光探針，高效遞送到活細胞內(nèi)，從而在單細胞水平檢測細胞內(nèi)的基因突變。

同時，該研究中基于微孔陣列的納米芯片，擁有細胞尋址的能力，它能對腫瘤細胞進行耐藥性原位分析。

4 月 8 日，Nano Letters 刊登了相關論文，論文題為 “Single Living Cell Analysis Nano-platform for High-throughput Interrogation of Gene Mutation and Cellular Behavior” 《用于基因突變和細胞行為高通量探測的單個活細胞分析納米平臺》，并成為 Nano Letters 內(nèi)封面文章。

其中，常凌乾擔任通訊作者，第一作者是北航生物醫(yī)學工程高精尖創(chuàng)新中心和生物醫(yī)學工程學院董再再博士。

研發(fā)多米諾 DNA 探針，比同類工具反應速度快 4 倍

常凌乾團隊利用 SLCA 平臺對肺癌患者臨床樣品進行了綜合分析，發(fā)現(xiàn)肺癌細胞的 EGFR 基因突變和相關靶向藥物耐受性之間，存在明顯的正相關性。

也就是說，細胞對靶向藥的敏感程度、和引起肺癌的某些基因突變細胞，呈現(xiàn)出比例上的正相關性。

因此，SLCA 平臺可為細胞內(nèi)基因檢測和單細胞分析提供一種通用方法，并有望大范圍用于指導臨床精準治療。

據(jù)了解，在肺癌基因突變中，EGFR（epidermal growth factor receptor）作為表皮生長因子受體家族的成員之一，其發(fā)生突變的存在率最高。

雖然 EGFR 靶向藥物可以延長肺癌患者存活期，但腫瘤細胞容易產(chǎn)生耐藥性，而這會導致靶向藥物失效。

因此，預估患者體內(nèi)是否發(fā)生 EGFR 突變，并借此推斷患者的腫瘤細胞對于靶向藥物的耐藥性，可有效提高肺癌治療效果。

研究中，常凌乾團隊設計出一種 DNA 探針，名字叫 Domino（下稱多米諾）。通過堿基互補配對的原則，這只探針可把成對的發(fā)夾 DNA 序列，組裝成致密的螺旋鏈。

與靶 RNA 孵育后，多米諾探針會在 30 分鐘內(nèi)快速反應，并使其熒光倍率增強，最終實現(xiàn)在單細胞內(nèi)具有較強的熒光檢測信號。

在目標 RNA 存在的情況下，由于鏈在螺旋方向上的鏈置換反應，多米諾探針被迅速觸發(fā)，并在 30 分鐘后，熒光強度會達到飽和。

與傳統(tǒng)的分子探針相比，多米諾探針的反應速度快了 4 倍，并能將熒光信號放大 12.5 倍。

為了實現(xiàn)高效、且安全的探針傳遞，同時允許在單細胞水平上、對細胞行為進行原位觀察，常凌乾課題組開發(fā)出一種納米芯片，該芯片可將多米諾探針傳遞到活細胞中，并可在芯片上進行細胞培養(yǎng)與觀察。

如下圖所示，從上到下來看，該納米芯片由三個部件組成：分別是用于細胞定位和培養(yǎng)的微孔陣列、用于探針輸送的納米孔、以及用于建立電場的電極。

圖 | 納米芯片結構（來源：受訪者）

其中，這些微孔陣列膜可被分為上腔和下腔，相關細胞和多米諾探針均會通過帶有納米孔的微孔陣列膜。

數(shù)以百萬計的單細胞排列在微孔陣列中，并與微孔底部的納米孔緊密相連。在外部低電壓下，納米孔會聚集電場，并在納米孔之間形成偏置電壓，從而穿透細胞膜。

通過使用此方法，可以巧妙避免同電荷細胞膜與多米諾探針之間的斥力問題，還能在可調(diào)節(jié)的電場下實現(xiàn)單細胞膜上的精確電穿孔，可控、高效、均勻地將多米諾探針傳遞進細胞。

此外，在芯片上，每個微孔都有一個唯一的地址，這樣就能聯(lián)合多米諾探針檢測并追蹤微孔中的每個細胞。

由于這些癌細胞都位于可尋址微孔中，因此在遞送之后，可實現(xiàn)細胞里的 EGFR 基因突變檢測，以及后續(xù)的耐藥性分析。

另據(jù)悉，在不同濃度的目標 RNA 存在下，熒光強度會隨著目標 RNA 濃度的增加而增強，并在 100 pM?100 nM 范圍內(nèi)呈線性關系，這表明多米諾探針具備識別靶 RNA 的高特異性。

相比傳統(tǒng)的分子信標（Molecular beacon，一種熒光標記的寡核苷酸鏈，但沒有熒光信號放大功能），在同樣條件下，多米諾探針明顯增加了輸出熒光，它的檢出限比傳統(tǒng)分子信標低 100 倍，這說明多米諾探針在敏感的基因突變檢測方面，具備一定優(yōu)勢。

為了對樣品進行平行測試，團隊在一個芯片上設計了三個平行的模塊，每個芯片單元在聚碳酸酯納米膜上制備有 10000 個微孔，從而實現(xiàn)高通量的細胞分析。

每個微孔只有 20μm 大小，為的是能適應大多數(shù)細胞的尺寸。研究中，他們采用納米孔直徑為 800nm 的納米孔膜，將電場定位到細胞膜上，隨后通過穿孔細胞膜，并利用電泳方式，將多米諾探針送到細胞中。

為了定位芯片上的每個單元，納米孔膜上的微孔被劃分成一個個 10×10 微孔的方形陣列，并使用數(shù)字進行標記。

例如，標記為 “4?9_J-5” 的微孔，位于納米孔膜的第四行和第九列。也就是說，即使芯片被重新安置，任何單個細胞也都能被尋址。

此外，當這些細胞排列成大規(guī)模的規(guī)則陣列，也可為后續(xù)基因分析和細胞行為的跟蹤，提供精確的單細胞分析平臺。

即使在 10V 的低電壓下，多米諾探針也能穿透細胞膜。另外，常凌乾團隊還比較了單個細胞在不同微孔和 BEP 中的跨膜電位。

由于微孔所提供的環(huán)境是均勻的，因此微孔中的細胞具備幾乎相同的跨膜電位，相比傳統(tǒng)的電穿孔方法（bulk electroporation），優(yōu)勢非常明顯。

這一結果表明，基于微孔陣列的導電納米芯片，能為每個細胞提供均勻分布的電場，這對于微孔中細胞的均勻電穿孔是非常必要的，也是實現(xiàn)多米諾探針均勻導電的前提條件。

研究中，常凌乾團隊分別選取了三種類型的肺癌細胞 H1975、HCC827 和 A549，來作為 EGFR L858R 突變陽性、EGFR 19 外顯子缺失突變陽性、以及 EGFR 突變野生型的模型。

考慮到高檢測信號和低細胞損傷的要求，他根據(jù)多米諾探針和碘化丙啶在細胞中的熒光強度，確定了 10 V 和 200 個脈沖作為最佳電傳遞條件。

他們發(fā)現(xiàn)，用電遞送納米芯片將多米諾探針注入細胞，30 分鐘內(nèi)突變細胞就會變亮。這些結果證實，組裝的多米諾探針在不影響累積率的情況下，實現(xiàn)了細胞內(nèi)目標 RNA 的熒光檢測。

流式細胞儀的結果也表明，本次研究中的納米平臺，可區(qū)分 90% 以上的突變陽性細胞。

考慮到所有細胞都可以在微孔陣列上直接被觀察到的特性，常凌乾團隊對變亮的細胞進行計數(shù)，得出突變陽性細胞的比例。

對比后他們發(fā)現(xiàn)，細胞的突變陽性率與流式細胞儀計數(shù)的結果一致，這表明該納米平臺具有高通量、單細胞分辨率的基因分析能力。

為了獲得較高的加載效率，該團隊還應用一種基于真空的設置，來將細胞加載到微孔中，從而讓細胞效率達到 85% 以上。

此納米平臺的遞送效率和細胞活性均達到 90% 以上，這也表明它在活細胞操作、探針遞送和細胞行為分析方面，具有很高的可行性和良好的性能。

概括來說，該研究工作研發(fā)了一種納米生物芯片，在原位進行高通量活細胞培養(yǎng)，并在活細胞內(nèi)探測突變基因，以及時空可控的分析同一細胞行為。未來有望能通過技術轉化，應用于臨床藥物篩選和精準醫(yī)療。這也是常凌乾從事科研的一個長期愿景。

談及未來，他告訴 DeepTech，國家十四五規(guī)劃已明確將單細胞技術、創(chuàng)新藥物作為優(yōu)先發(fā)展領域。能在單細胞精度解析細胞的技術，是未來生物技術領域的重點之一。他們課題組將繼續(xù)致力于設計新型的可以在單細胞精度上操控和改造細胞的新技術，并為未來能直接應用于臨床診斷和在體治療而奮斗。

原文標題：每分鐘8名中國人確診患癌！北航教授研發(fā)納米芯片，30分鐘即可解析肺癌細胞基因突變 | 專訪

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責任編輯：haq