用于連續(xù)監(jiān)測(cè)生物分子濃度的傳感器對(duì)于在病人護(hù)理、工業(yè)流程以及環(huán)境安全和可持續(xù)性方面開發(fā)基于生化的監(jiān)測(cè)和控制策略是必需的。傳統(tǒng)的生物傳感器具有宏觀的感測(cè)區(qū)域，例如電極或光學(xué)探測(cè)的表面積，收集的信號(hào)源自大量分子集合的相互作用，而無法解析單分子層面的相互作用。近年來，傳感器已經(jīng)被微型化，并且開發(fā)出了由微型傳感器陣列組成的傳感器，其中每個(gè)單獨(dú)的傳感器都足夠小，能夠解析由單分子相互作用引起的轉(zhuǎn)變。本文用于研究由單分子分辨率傳感器陣列組成的連續(xù)傳感器中的功能異質(zhì)性，通過將傳感器暴露于分析物濃度變化（增加和減少）超過長時(shí)間跨度（25小時(shí)）。 該方法是一種基于數(shù)千個(gè)生物功能化粒子與生物功能化感測(cè)表面相互作用的連續(xù)生物傳感技術(shù)。揭示了異質(zhì)性是由粒子和表面上親和力分子數(shù)量的隨機(jī)波動(dòng)引起的，并且響應(yīng)特性的逐漸變化與單粒子傳感器中分子的逐漸損失有關(guān)。結(jié)果表明了顯著的分子和時(shí)間異質(zhì)性，并提供了如何為單分子分辨率的連續(xù)親和力基礎(chǔ)生物分子監(jiān)測(cè)設(shè)計(jì)、精確和穩(wěn)定的傳感器的思路。

近日，來自荷蘭埃因霍溫理工大學(xué)復(fù)雜分子系統(tǒng)研究所（ICMS）W. J. Prins團(tuán)隊(duì)，在《Advanced Science》雜志發(fā)表了題為“How Highly Heterogeneous Sensors with Single-Molecule Resolution can Result in Robust Continuous Monitoring Over Long Time Spans”的文章。該研究對(duì)具有單分子分辨率的生物分子傳感器由大量傳感器組成，這些傳感器測(cè)量與單分子結(jié)合和解離事件相關(guān)的態(tài)變化。傳統(tǒng)上，為了獲得足夠的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，會(huì)從許多單獨(dú)的傳感器中聚合信號(hào)。然而，通過聚合信號(hào)，傳感器之間的差異會(huì)丟失，異質(zhì)性也無法被研究。在這里，我們研究了長時(shí)間跨度內(nèi)具有單分子分辨率的傳感器，這使得可以從獨(dú)立的傳感器中收集足夠的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。這允許比較傳感器，揭示了它們分子組裝中與隨機(jī)變化相關(guān)的基本異質(zhì)性。該研究是通過粒子運(yùn)動(dòng)生物傳感進(jìn)行的，這是一種與數(shù)千個(gè)粒子動(dòng)態(tài)與感測(cè)表面相互作用的傳感方法。在25小時(shí)內(nèi)，對(duì)分析物濃度的一系列調(diào)制中，研究了單個(gè)粒子的信號(hào)。這些結(jié)果提供了對(duì)具有單分子分辨率的連續(xù)傳感器的分子和時(shí)間異質(zhì)性的見解，并解釋了如何設(shè)計(jì)傳感器以實(shí)現(xiàn)穩(wěn)健、精確和穩(wěn)定的生物分子監(jiān)測(cè)。 本文主要關(guān)注了如何在基本的單分子層面上研究、理解和利用基于親和力的傳感器的功能特性。將為實(shí)現(xiàn)能夠長時(shí)間跨度內(nèi)精確和穩(wěn)定監(jiān)測(cè)生物分子的傳感器的工程策略和設(shè)計(jì)奠定基礎(chǔ)，以滿足廣泛的應(yīng)用需求。

圖1基于親和力的生物分子結(jié)合轉(zhuǎn)化為測(cè)量信號(hào)的傳感過程

傳感器分為三類：i) 基于集合的傳感器，ii) 具有單分子分辨率的傳感器組合，以及 iii) 具有單分子分辨率的單個(gè)傳感器探測(cè)。具有單分子分辨率的轉(zhuǎn)導(dǎo)方法能夠區(qū)分和計(jì)數(shù)單個(gè)單分子結(jié)合和解離事件。劑量-反應(yīng)關(guān)系通常通過聚合單分子數(shù)據(jù)和許多單獨(dú)傳感器組合信號(hào)來建立。組合增加了測(cè)量數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)量，然而，平均過程會(huì)導(dǎo)致關(guān)于異質(zhì)性的信息丟失，例如分子之間的差異、分子相互作用之間的差異以及傳感器之間的差異。 作者深入研究了具有單分子分辨率的傳感器之間的差異，以研究變異性并理解高度異質(zhì)性傳感器如何能夠在長時(shí)間跨度內(nèi)實(shí)現(xiàn)穩(wěn)健的連續(xù)監(jiān)測(cè)。BPM被用作模型系統(tǒng)（圖1B）。BPM是一種利用生物功能化的微米級(jí)粒子作為具有單分子分辨率的傳感器的生物傳感方法。粒子的運(yùn)動(dòng)特性受到粒子和感測(cè)表面之間可逆親和力單分子相互作用的影響。在實(shí)驗(yàn)中，粒子通過柔性的雙鏈DNA系繩附著在基質(zhì)上，將每個(gè)微米級(jí)粒子限制在傳感器表面上的亞微米級(jí)區(qū)域。使用寬場(chǎng)光學(xué)顯微鏡實(shí)時(shí)測(cè)量每個(gè)粒子的運(yùn)動(dòng)軌跡。 ? 圖2在BPM傳感器中探測(cè)單個(gè)粒子，以獲得25小時(shí)內(nèi)的單粒子響應(yīng) 本研究中使用的實(shí)驗(yàn)設(shè)置將粒子被固定在流動(dòng)池內(nèi)的表面上，該流動(dòng)池連接到一個(gè)定制的流體系統(tǒng)，用于長時(shí)間跨度的自動(dòng)化流體交換。作者使用了一個(gè)基于競爭的BPM傳感器進(jìn)行測(cè)量，該傳感器旨在連續(xù)監(jiān)測(cè)小分子（糖苷生物堿）。粒子與分析物類似分子的結(jié)合導(dǎo)致粒子的運(yùn)動(dòng)自由度減少，即粒子從未結(jié)合狀態(tài)轉(zhuǎn)換為結(jié)合狀態(tài)。粒子的視頻圖像被實(shí)時(shí)處理，以定位每個(gè)粒子的x和y位置作為時(shí)間的函數(shù)。然后分析運(yùn)動(dòng)軌跡以確定切換事件和粒子的相應(yīng)時(shí)間依賴狀態(tài)。10個(gè)分析物濃度-時(shí)間曲線系列在25小時(shí)內(nèi)順序應(yīng)用于單個(gè)流動(dòng)池，每個(gè)系列由8個(gè)不同分析物濃度的流體應(yīng)用組成。在每次流體應(yīng)用后跟蹤粒子15分鐘（圖2B）。在高分析物濃度下，活動(dòng)低，因?yàn)榱Ｗ又饕幱谖唇Y(jié)合狀態(tài)，因?yàn)榭贵w被分析物分子占據(jù)，很少與感測(cè)表面上的分析物類似物結(jié)合。黑色曲線顯示了粒子集合的平均響應(yīng)，與溶液中分析物濃度呈負(fù)相關(guān)，這符合基于競爭的傳感器的預(yù)期（圖2B）。有趣的是，單個(gè)粒子的響應(yīng)（紅色）顯示出高度的變化：不同的粒子顯示出明顯不同的行為。這些差異可能由時(shí)間和非時(shí)間異質(zhì)性引起。時(shí)間異質(zhì)性與單個(gè)粒子在結(jié)合和未結(jié)合狀態(tài)之間轉(zhuǎn)換的時(shí)間點(diǎn)的隨機(jī)性有關(guān)。三個(gè)選定粒子的DRCs，分別為它們的第一個(gè)濃度系列（左）和所有十個(gè)濃度系列的時(shí)間平均（右）。根據(jù)粒子集合的平均響應(yīng)，一些粒子確實(shí)顯示出S形曲線，但令人驚訝的是，粒子也顯示出鐘形曲線（圖2C）。

圖3對(duì)具有不同數(shù)量的粒子端結(jié)合分子（NPSB）和基質(zhì)端結(jié)合分子 一個(gè)競爭性的基于粒子的傳感器被建模為具有NPSB（粒子端結(jié)合分子，PSBs）與溶液中的分析物分子以及感測(cè)表面上的NSSB（基質(zhì)端結(jié)合分子，SSBs）相互作用。顯示了不同數(shù)量的粒子結(jié)合分子和恒定數(shù)量的基質(zhì)結(jié)合分子（NSSB = 10）的模擬時(shí)間軌跡示例（圖3B）。突出顯示了兩個(gè)時(shí)間依賴的粒子屬性：PSBs和SSBs之間形成的鍵的數(shù)量（左y軸，紅色曲線）和觀察到的粒子狀態(tài)（右y軸，灰色曲線）。當(dāng)沒有PSB-SSB鍵時(shí)，粒子狀態(tài)為未結(jié)合，當(dāng)至少有一個(gè)PSB-SSB鍵時(shí)，粒子狀態(tài)為結(jié)合。圖3C顯示了單鍵時(shí)間分?jǐn)?shù)，即在只有一個(gè)PSB-SSB鍵時(shí)，粒子在單鍵狀態(tài)下花費(fèi)的平均時(shí)間分?jǐn)?shù)。對(duì)于少量的粒子端結(jié)合分子，隨著基質(zhì)端結(jié)合分子數(shù)量的增加，單鍵時(shí)間分?jǐn)?shù)增加。然而，對(duì)于大量的粒子端結(jié)合分子，由于形成了多個(gè)鍵，該分?jǐn)?shù)減少。圖3D顯示了對(duì)劑量-反應(yīng)關(guān)系的影響，粒子切換活動(dòng)繪制在y軸上。對(duì)于少量的結(jié)合分子，DRC呈現(xiàn)S形，并且隨著結(jié)合分子數(shù)量的增加，曲線向右移動(dòng)。

圖4利用信號(hào)-時(shí)間曲線的相位對(duì)單粒子響應(yīng)特性進(jìn)行分類

不同顏色表示不同的區(qū)間，在4A和4B兩個(gè)面板中均有顯示（圖4A，4B ）。數(shù)據(jù)顯示不同的相移區(qū)間與不同的DRC特征相關(guān)，從無響應(yīng)（暗紅色）到S形（橙色）到鐘形（綠色）。作者在本研究中，開發(fā)的分類方法可以研究粒子如何在長時(shí)間跨度內(nèi)改變它們的DRC特征。結(jié)果也顯示了粒子在25小時(shí)內(nèi)如何改變它們的DRC特征（圖4C，4D）。頂部面板與最初（在t = 0時(shí)）在面板A和B的橙色區(qū)間內(nèi)的粒子有關(guān)，在所有面板中，紅色曲線表示第一個(gè)DRC（在0到2.5小時(shí)之間測(cè)量），藍(lán)色曲線表示最后一個(gè)DRC（在22.5到25小時(shí)之間測(cè)量）。頂部面板的結(jié)果表明，最初具有S形DRC的粒子在25小時(shí)內(nèi)保持相同的DRC形狀和相同的相位偏移，而信號(hào)的幅度隨時(shí)間減少。底部面板顯示，最初具有鐘形DRC的粒子將其特征轉(zhuǎn)變?yōu)镾形DRC（具有較低的相位偏移）。具有鐘形DRC的粒子具有大量的結(jié)合分子和多價(jià)相互作用，因此失去結(jié)合分子將增加具有單價(jià)鍵的可能性，因此將DRC向S形特征轉(zhuǎn)移。 在粒子與表面之間的結(jié)合主要由單價(jià)鍵主導(dǎo)的區(qū)域中進(jìn)行的測(cè)量和模擬可以用來估計(jì)傳感器中結(jié)合分子的損失率。在單價(jià)結(jié)合區(qū)域，粒子具有S形DRCs，觀察到的活動(dòng)速度逐漸以每小時(shí)約1.6 ± 0.2%的速率減少（圖4C）。 文章鏈接：https://doi.org/10.1002/advs.202412181 ? ? ? 審核編輯 黃宇