介紹

準(zhǔn)確、快速、無(wú)創(chuàng)地檢測(cè)和診斷組織中的惡性疾病是生物醫(yī)學(xué)研究的重要目標(biāo)。漫反射、熒光光譜和拉曼光譜等光學(xué)方法都已被研究作為實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)的方法。漫反射利用組織的吸收和散射特性，特別是細(xì)胞核和基質(zhì)的吸收和散射特性。由于血紅蛋白含量的變化3和新血管形成4，組織變得更加發(fā)育不良，組織的散射特性發(fā)生變化。熒光光譜也受到組織光學(xué)特性變化的影響，并已用于診斷發(fā)育不良。然而，這些技術(shù)存在許多缺點(diǎn)，包括需要大量樣品制備或切除，以及靈敏度和特異性較低。

許多研究小組轉(zhuǎn)而使用拉曼光譜來(lái)檢測(cè)和診斷 體內(nèi)疾病，而無(wú)需去除組織或添加外源性試劑。拉曼光譜是一種基于拉曼散射的方法，是一種強(qiáng)大的技術(shù)，可應(yīng)用于許多組織部位。拉曼光譜是一種分子特異性技術(shù)，可探測(cè)化學(xué)鍵中的振動(dòng)或旋轉(zhuǎn)躍遷，并提供有關(guān)樣品生化成分的詳細(xì)信息。該技術(shù)的靈敏度非常高，以至于拉曼光譜實(shí)際上是組織生化組成的精確指紋。

我們開發(fā)了一種基于探針的拉曼光譜系統(tǒng)，可以在體內(nèi)非侵入性地獲取拉曼光譜，用于我們的研究。我們小組的總體目標(biāo)是使用拉曼光譜成功檢測(cè)和診斷異常組織，無(wú)論患者的年齡、種族、體重指數(shù) (BMI) 或病史如何。已經(jīng)建立了幾乎相同的系統(tǒng)來(lái)獲取拉曼數(shù)據(jù)以研究各種惡性腫瘤，例如宮頸發(fā)育不良、宮頸早產(chǎn)的變化、皮膚癌、結(jié)腸癌和乳腺腫瘤邊緣。采集后，拉曼光譜經(jīng)過(guò)校準(zhǔn)以考慮日常變化，并進(jìn)行處理以減去背景熒光和平滑的噪音。最后，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析以確定拉曼光譜是否能夠診斷惡性區(qū)域。

裝置和方法

圖 1 顯示了一個(gè)實(shí)驗(yàn)裝置的原理圖和圖片。它由連接到 785 nm 二極管激光器(來(lái)自 Process Instruments, Inc. 或 Innovative Photonics Solutions)的 EMVision 光纖探頭、Kaiser Optical Systems 成像光譜儀(Holospec)組成。 ，f/1.8i-NIR)和背照式、深耗盡、熱電冷卻的 Princeton Instruments CCD 相機(jī)(PIXIS 256BR)。這些系統(tǒng)均由筆記本電腦使用 Princeton Instruments (Winspec) 提供的軟件進(jìn)行控制。在大多數(shù)實(shí)驗(yàn)方案中，光纖探頭將80 至 100 mW 的光傳送到組織上，積分時(shí)間為2-5 秒。測(cè)量期間，所有房間燈光和計(jì)算機(jī)顯示器均關(guān)閉。實(shí)現(xiàn)了8個(gè)波數(shù)(cm -1 )的光譜分辨率。

對(duì)于這些研究，我們開發(fā)了 7-around-1 光纖探頭。激發(fā)光纖直徑為 400 μm，每根收集光纖直徑為 300 μm。以下是獲取拉曼數(shù)據(jù)的典型協(xié)議。首先，用干棉簽清潔審訊區(qū)域，然后用鹽水清潔。關(guān)閉燈后，將拉曼探頭放置在該區(qū)域上并進(jìn)行測(cè)量。當(dāng)所有測(cè)量完成后，將探頭擦干凈，放入10% 漂白劑溶液中至少 10 分鐘，然后放入去離子水中5-10 分鐘。

一般來(lái)說(shuō)，獲取拉曼光譜的方案是由研究目標(biāo)決定的。對(duì)于我們的宮頸發(fā)育不良研究，數(shù)據(jù)是從兩組患者群體中獲取的：1)來(lái)診所進(jìn)行篩查的大部分正常人群;2)來(lái)診所進(jìn)行疾病診斷的患病人群。在第一組患者中，清潔子宮頸，然后從子宮頸的三個(gè)區(qū)域獲取拉曼光譜。光譜與所得病理報(bào)告相關(guān)，病理報(bào)告可以是正常細(xì)胞、非典型細(xì)胞、低度不典型增生或高度不典型增生。在第二組患者中，患者已經(jīng)接受過(guò)篩查用于宮頸不典型增生，并且具有非典型細(xì)胞、低度或高度不典型增生。

圖 1： a) 體內(nèi)拉曼光譜設(shè)置圖示，包括二極管激光器、探針(帶有探針前列的詳細(xì)信息)、光譜儀和 CCD 相機(jī)。 b) 推車上的系統(tǒng)照片，可供診所使用。注意指向探頭的黃色箭頭。

在此檢查期間，將醋酸放置在子宮頸上，使任何異常區(qū)域變白。然后從醫(yī)療提供者決定活檢的任何區(qū)域以及一個(gè)視覺(jué)正常區(qū)域獲取拉曼光譜。然后進(jìn)行活檢。該手術(shù)的病理結(jié)果為陰性、炎癥/化生、宮頸上皮內(nèi)瘤變 I-III 級(jí) (CIN I-III) 或原位癌 (CIS)。

然后對(duì)拉曼數(shù)據(jù)進(jìn)行校準(zhǔn)和處理，以減去背景熒光并平滑噪聲。這些方法已在前面描述過(guò)。在宮頸不典型增生檢測(cè)中，稀疏多項(xiàng)邏輯回歸 (SMLR)用于將每位患者的光譜分類為正常、良性、低級(jí)別 (CIN I) 或高級(jí)別 (CIN II 或 III)。簡(jiǎn)而言之，SMLR 是一個(gè)貝葉斯機(jī)器學(xué)習(xí)框架，它根據(jù)標(biāo)記的訓(xùn)練集計(jì)算屬于每個(gè)組織類別的頻譜的后驗(yàn)概率。第 1 組使用對(duì)每位患者的拉曼測(cè)量進(jìn)行平均的復(fù)合光譜。對(duì)于第二組，使用每個(gè)單獨(dú)的光譜，因?yàn)樗鼈兪菑目梢耘c特定病理報(bào)告相匹配的不同位點(diǎn)獲得的。

結(jié)果與討論

使用拉曼光譜檢測(cè)宮頸發(fā)育不良一直是我們實(shí)驗(yàn)室正在進(jìn)行的研究。在我們最初的研究中，光譜是從因良性或惡性疾病而接受全子宮切除術(shù)的患者的子宮頸獲取的。在這些研究中，拉曼光譜被分類為正常、良性或惡性，敏感性為89%，特異性為81%。盡管這些結(jié)果與使用標(biāo)準(zhǔn)臨床技術(shù)時(shí)發(fā)現(xiàn)的結(jié)果相似，但它們沒(méi)有提供足夠的證據(jù)證明拉曼光譜可以成功診斷宮頸發(fā)育不良并易于在臨床中實(shí)施。

最近，我們一直在收集上述設(shè)置和方法部分中所述的數(shù)據(jù)，這導(dǎo)致了對(duì)500 多名患者的測(cè)量。在第一組研究中，從兩個(gè)患者組獲取光譜并進(jìn)行分類，準(zhǔn)確率超過(guò) 88%。雖然這些結(jié)果仍然不適用于臨床，但用于對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分類的方法 (SMLR) 顯示正常數(shù)據(jù)之間存在很大差異。

進(jìn)一步的研究集中在尋找這種差異的來(lái)源并檢查它們是否影響疾病譜的分類。例如，我們之前的工作表明，差異可能是由于正常月經(jīng)周期和絕經(jīng)前后荷爾蒙水平的變化造成的。 此外，疾病的存在會(huì)永久改變子宮頸，從而改變從子宮頸獲取的拉曼光譜(圖 2)。在疾病分類之前將這些結(jié)果納入 SMLR 算法，將每項(xiàng)研究的分類準(zhǔn)確度提高到94%和97%。

圖 2：宮頸不同區(qū)域的平均歸一化拉曼光譜。

目前，我們正在研究可能由種族、胎次、社會(huì)經(jīng)濟(jì)地位和體重指數(shù)引起的差異。我們的初步結(jié)果表明，奇偶性，即比較已生育過(guò)的女性和從未懷孕過(guò)的女性的拉曼測(cè)量值，以及體重指數(shù)的變化對(duì)正常拉曼光譜的色散有顯著影響(正在出版)。正在進(jìn)行研究，看看考慮到這些變化是否也會(huì)導(dǎo)致疾病分類率增加，類似于激素狀態(tài)和既往疾病的結(jié)果。

由于我們的系統(tǒng)中使用的技術(shù)日益復(fù)雜，這些細(xì)微的變化僅被觀察、解釋并納入疾病分類算法中，以提高敏感性和特異性。具體來(lái)說(shuō)，光纖探頭和CCD 相機(jī)是不可替代的組件，它們極大地提高了系統(tǒng)的分辨率，使我們能夠檢測(cè)到由于正常患者變化而引起的微小變化。考慮到這些變化使算法能夠?qū)Ｗ⒂跈z測(cè)疾病引起的變化，從而提高疾病分類率。

未來(lái)的方向

雖然本說(shuō)明的重點(diǎn)是使用拉曼光譜來(lái)檢測(cè)宮頸發(fā)育不良，但我們的研究小組和其他人也利用拉曼光譜來(lái)檢測(cè)其他組織部位的惡性腫瘤，例如乳房、皮膚、結(jié)腸和前列腺。此外，拉曼還被探索作為一種檢測(cè)內(nèi)分泌腺、臨產(chǎn)跡象的子宮頸變化和炎癥性腸病的方法。如上所述，光纖探頭可以單獨(dú)使用，也可以插入內(nèi)窺鏡等臨床工具中，以收集拉曼數(shù)據(jù)。

拉曼光譜還有許多不同于傳統(tǒng)光纖探頭的用途?？臻g偏移拉曼光譜 (SORS)已被開發(fā)出來(lái)，通過(guò)分離探針內(nèi)的纖維來(lái)探查更深層的組織。 SORS 已用于骨骼應(yīng)用和評(píng)估腫瘤邊緣。表面增強(qiáng)拉曼光譜 (SERS)依賴于添加金屬表面后拉曼信號(hào)的增加，例如將金納米顆粒應(yīng)用于樣品后。該技術(shù)已開發(fā)用于體內(nèi)使用以及拉曼顯微鏡。最后，拉曼顯微鏡提供了更高的分辨率比基于探針的系統(tǒng)可以實(shí)現(xiàn)的目標(biāo)。這些系統(tǒng)中的大多數(shù)不能用于體內(nèi)診斷，但是目前正在進(jìn)行將顯微鏡的分辨率與拉曼的準(zhǔn)確性相結(jié)合的方法的研究，例如共焦拉曼光譜。

拉曼光譜有潛力幫助解決醫(yī)學(xué)界面臨的許多問(wèn)題。使用優(yōu)化的設(shè)備對(duì)于最大限度地成功應(yīng)用該技術(shù)進(jìn)行疾病診斷至關(guān)重要。我們相信，隨著技術(shù)的不斷進(jìn)步，醫(yī)療服務(wù)提供者將從傳統(tǒng)技術(shù)轉(zhuǎn)向拉曼光譜等光學(xué)方法，以提供快速、準(zhǔn)確、非侵入性的診斷。

審核編輯 黃宇