圖 1： 橫向普克爾斯盒操作的簡化表示。 通過調(diào)整施加的電場調(diào)制透過分析儀的透射率。

自從雙光子激光掃描熒光顯微鏡方面的開創(chuàng)性著作(登克等人，1990 年)于 1990 年發(fā)表以來，該技術(shù)已經(jīng)從激光技術(shù)的巨變中受益。 這些改進進一步推動了這種最初從物理實驗室中開發(fā)的技術(shù)向細胞生物學(xué)、疾病研究和高級神經(jīng)科學(xué)成像領(lǐng)域的滲透。

一體式可調(diào)諧鈦寶石激光器在 2001 年左右開始了這一趨勢。幾年后，激光器中增加了自動色散控制功能，以優(yōu)化顯微鏡樣品平面的脈沖持續(xù)時間。 隨著在超過鈦寶石激光器上限的波長下可激發(fā)的探測脈沖變得更加成熟和高效，2010 年之后，激光器公司轉(zhuǎn)向了光學(xué)參量振蕩器來滿足對多顏色維度、更深成像和更少光損傷的需求。

在本文中，我們將討論這一演變的下一階段，即快速功率調(diào)制在激光系統(tǒng)中的集成，并討論這個階段將如何實現(xiàn)更快的設(shè)置時間、比較高的性能和更低的擁有成本。

雙光子顯微成像中的激光功率控制要求。

在最簡單的顯微鏡中，可以通過添加相位延遲波片和偏振分析儀來實現(xiàn)對激光功率的連續(xù)控制。 通過旋轉(zhuǎn)波片，激光功率透過分析儀的透射率通?？梢詮?0.2% 透射率變?yōu)?99% 左右。 例如，通過電動旋轉(zhuǎn)波片，該過程可以自動改變顯微鏡中成像平面的功率，以均衡不同深度幀處的聚焦積分通量。

圖 2： 雙光子顯微鏡上的典型普克爾斯盒部署。 EOM 位于用戶右下方。 英國牛津大學(xué) Packer 實驗室提供照片。

不過，大多數(shù)現(xiàn)代激光掃描雙光子顯微鏡都需要更快的調(diào)制速度。 例如，對于僅應(yīng)在單個方向上進行數(shù)據(jù)采集的光柵激光掃描應(yīng)用，在“反激操作”期間必須消隱激光以避免不必要的熒光激發(fā)或光漂白。 如果是共振振鏡掃描儀，得到的上升/下降時間可能短至幾微秒。 在這一領(lǐng)域，必須考慮光調(diào)制方法。

電光調(diào)制

電光調(diào)制器 (EOM) 利用普克爾斯效應(yīng)，通過對光束施加相位延遲來調(diào)制激光功率。 在電光調(diào)制器中，通過施加電場，在非中心對稱的晶體中誘發(fā)雙折射。 和以前一樣，使用偏振分析儀來完成調(diào)制器設(shè)置。

可以在縱向激發(fā)幾何結(jié)構(gòu)中配置普克爾斯盒，以適應(yīng)具有相對較短晶體的較大光束。 在這種情況下，典型的 1?2 波電壓(即偏振旋轉(zhuǎn) 90 度所需的電壓)約為 6 kV，這在 2P 顯微鏡所需的速度和占空比下難以實現(xiàn)。 因此，大多數(shù)成像配置采用橫向電場幾何結(jié)構(gòu)，使用更長的晶體，這會顯著降低半波電壓。 晶體通常采用 2 種或更多種串行配置進行部署，彼此相對旋轉(zhuǎn)，以進一步降低所需的開關(guān)電壓并補償熱負載效應(yīng)。

圖 3： Chameleon Discovery NX TPC 和調(diào)制后的典型最大輸出功率

必須注意通過晶體校準和偏移(偏置)電壓調(diào)整來優(yōu)化脈沖對比度(最小與最大發(fā)射功率的比率)以獲得優(yōu)異的圖像對比度。

普克爾斯盒在雙光子顯微成像中得到了廣泛采用，在“自制者”社區(qū)中尤為明顯，因為其部署相對簡單，特別是對于只需要在常用雙光子波長下使用適度功率的用戶。

例如，基于磷酸二氘鉀 (KD*P) 的盒可為高達約 1100nm 的 2P 應(yīng)用提供出色的透射率、速度和對比度特性，并可提供適中的激光功率。 此外，KD*P 具有很低的群速度色散特性，從而顯著減小群延遲色散 (GDD)。 為此，在使用沒有色散預(yù)補償和有限調(diào)諧的超快激光器時(例如鈦寶石激光器)，KD*P 普克爾斯盒是一種熱門選擇。

聲光調(diào)制

聲光調(diào)制器 (AOM) 包含一個透明晶體或玻璃，其上附有一個壓電換能器。 施加到該換能器的射頻 (RF) 波會誘發(fā)聲波，使晶體產(chǎn)生應(yīng)變，從而形成折射率光柵。 穿過細胞的光會經(jīng)歷布拉格衍射。

可實現(xiàn)的上升/下降時間與聲波穿過激光束所需的時間成正比，因此可以通過減小晶體中的光束寬度進行優(yōu)化。

辨別力和對比率由第零個和第一個衍射極之間的分離角 (θS) 以及到關(guān)注的工作平面的距離進行定義。

雙光子顯微成像中最常用的 AOM 材料是二氧化碲 (TeO2)。 這種材料在很寬的波長范圍內(nèi)具有出色的衍射效率和高功率處理能力。 使用 30 dBm 左右的適中 RF 功率時可實現(xiàn)高透射效率。

圖 4： 可以使用提供的 GUI 直接更改輸出功率，或者用戶可以為逆程消隱和快速抖動控制提供額外的快速模擬輸入

TeO2 AOM 通常配置在布拉格相互作用區(qū)中，該區(qū)提供優(yōu)異的一階衍射效率，并徹底湮滅高階。 請注意，要以極低的 RF 功率級實現(xiàn)高效率，需要長度大于 1 cm 的晶體，從而導(dǎo)致不可忽略的群延遲色散 (GDD)。 另外考慮到其他下游光學(xué)器件的色散，尤其是物鏡，基于 AOM 的顯微鏡系統(tǒng)可以通過與配備色散預(yù)補償功能的激光器聯(lián)合使用而受益，以在樣品平面上維持盡可能短的脈沖。

為可調(diào)諧激光器部署 AOM 需要細致的光學(xué)和控制電子學(xué)設(shè)計。 由于分離角 (θs) 取決于 RF 驅(qū)動頻率(即光柵周期)和激光波長，因此必須仔細校準 RF 驅(qū)動頻率，以確保在調(diào)諧激光波長時顯著減小指向變化。 此外，還應(yīng)在不同 RF 功率下為不同波長實現(xiàn)高衍射效率。 盡管 AOM 具有出色的性能特點，但由于需要仔細控制 RF 頻率和功率，并需要在可調(diào)諧成像系統(tǒng)中管理相對較大的 GVD，因此集成工作變得更加繁重，到目前為止，這已經(jīng)限制了 AOM 在許多自制者和定制場景中的使用。

寬可調(diào)激光器中的調(diào)制

約 680-1300 nm 波長且功率超過 2 W 的一體式寬可調(diào)諧激光器的出現(xiàn)，需要為激光調(diào)制的性能和集成工作實施一種新的機制。

圖 5： Discovery TPC 支持的高對比度、快速幀速率鈣成像示例。[1](在 1100nm 激光激發(fā)下表達 RCaMP1.07 的神經(jīng)元(紅色)和在 940nm 激光激發(fā)下表達 GCaMP6s 的星形膠質(zhì)細胞(綠色)的重疊圖，小鼠活體內(nèi)。 激發(fā)源 Chameleon Discovery TPC。 蘇黎世大學(xué) Weber 實驗室供圖)

通常使用的 KD*P 普克爾斯盒在高功率下會顯示熱暈效應(yīng)，這對光束指向、束腰完整性和壽命都是有害的。 更長的波長會進一步帶來更高驅(qū)動電壓和對比率挑戰(zhàn)。 鉭酸鋰是一種可行的 EOM 材料，可用于更寬的調(diào)諧，但商業(yè)裝置的群延遲色散高于色散補償激光器的可校正范圍，從而導(dǎo)致更長的脈沖并降低峰值功率，不利于高效成像。

如前所述，盡管具有潛在的成本和性能優(yōu)勢，但基于 AOM 的解決方案需要高度的光學(xué)設(shè)計和電子控制專業(yè)知識才能部署，許多生物成像設(shè)施中通常并不具有此類裝置。 即便如此，仍可作為一種集成解決方案從某些顯微鏡供應(yīng)商購買 AOM 解決方案。

2017 年，相干公司意識到，將 AOM 調(diào)制與激光源集成在一起的配套式解決方案將會讓用戶和顯微鏡行業(yè)受益。 基于從工業(yè)超快加工激光器的集成 AOM 解決方案中收集到的專業(yè)知識，相干公司開發(fā)了全功率控制 (TPC)，作為 Chameleon Discovery 激光器的完全集成選項。

自動免持包裝中的 Chameleon Discovery NX 上提供的全功率控制可在 660 nm 至 1320nm 的整個全倍頻程調(diào)諧范圍內(nèi)提供高對比度 (>1000:1) 和高速(上升時間 <1 μs)調(diào)制。

RF 頻率和功率校準與調(diào)整的所有繁瑣要求都已在激光器內(nèi)部進行編程，因此用戶或顯微鏡集成商只需提供所需的設(shè)定波長和功率級即可。

由于 AOM 非常經(jīng)濟高效，因此，Chameleon Discovery NX TPC 的固定波長 1040 nm 輸出還配備了自己的AOM 和驅(qū)動器。可以通過串行/USB 命令或快速模擬控制輸入方便地控制功率。

未來趨勢

隨著雙光子成像技術(shù)應(yīng)用范圍向 OEM 和臨床前應(yīng)用的進一步拓展，人們對經(jīng)濟高效的單波長飛秒光源的需求日益增長。 Axon 系列緊湊型超快光源完全滿足了這些要求。

圖 6： 所有 Axon 激光器都以共同的外形尺寸提供 TPC 功能選件。

從產(chǎn)品概念設(shè)計階段開始，TPC 功能就被集成到了 Axon 設(shè)計中，以簡化向新顯微鏡設(shè)計和應(yīng)用中的部署。 對于雙光子顯微鏡系統(tǒng)只是活動式診斷、臨床或高通量篩選設(shè)備的一部分而不是單純研究儀器的應(yīng)用，這帶來了終極集成便利性。

圖 7： Chameleon Discovery NX TPC 與 Axon 920 TPC 聯(lián)合使用。 TPC 可簡化光學(xué)布局并節(jié)省寶貴的載臺空間。 照片由多倫多兒童醫(yī)院 Neil Merovitch 提供。

在神經(jīng)科學(xué)研究中，高功率激光器在使用光遺傳學(xué)刺激的全光體內(nèi)成像技術(shù)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用(Yuste，2012 年)。 數(shù)十瓦的激光功率通過空間光調(diào)制器 (SLM) 拆分成能夠單獨處理數(shù)十或數(shù)百個神經(jīng)元的單獨細光束。 這種光控制方法需要短且可定制的突發(fā)脈沖。 由于采用全光纖設(shè)計方式，相干公司 Monaco 這樣的高功率光纖激光器可提供此類應(yīng)用所需的靈活性。 由此產(chǎn)生的高平均功率、高能量激光要求以及在亞毫秒時間尺度上切換刺激光束的需求為現(xiàn)有的普克爾斯盒技術(shù)帶來了具體挑戰(zhàn)。 為此，AOM 技術(shù)已完全集成到 Monaco 中，以實現(xiàn)精致的脈沖控制、簡化的顯微鏡設(shè)計并提高成像系統(tǒng)的可靠性。

結(jié)論

在本技術(shù)說明中，我們討論了對雙光子顯微成像中使用的飛秒激光器的激光輸出功率進行調(diào)制的兩種主要方法：電光調(diào)制和聲光調(diào)制。 迄今為止，大多數(shù)“自制者”都選擇了 EOM，因為在光路中部署這種高壓驅(qū)動設(shè)備相對簡單。 顯微鏡的供應(yīng)商們將其 EOM 或 AOM 部分集成在其激光傳輸系統(tǒng)中，利用其軟件架構(gòu)同時控制顯微鏡和激光。 相干公司利用其為制造 24/7 環(huán)境設(shè)計的高功率光纖激光器的制造經(jīng)驗，意識到 AOM 方法在尺寸、成本、速度和整體性能方面的優(yōu)勢也將滿足雙光子成像應(yīng)用的要求。 無論是先進的神經(jīng)科學(xué)應(yīng)用還是醫(yī)學(xué)診斷應(yīng)用，通過將 AOM 的復(fù)雜控制集成到 Discovery NX、Axon 和 Monaco 的激光軟件和硬件架構(gòu)中，雙光子用戶(自制者和顯微鏡公司)可以從較大簡化且易于控制的光學(xué)裝置中受益。

在本技術(shù)說明中，我們討論了對雙光子顯微成像中使用的飛秒激光器的激光輸出功率進行調(diào)制的兩種主要方法：電光調(diào)制和聲光調(diào)制。 迄今為止，大多數(shù)“自制者”都選擇了 EOM，因為在光路中部署這種高壓驅(qū)動設(shè)備相對簡單。 顯微鏡的供應(yīng)商們將其 EOM 或 AOM 部分集成在其激光傳輸系統(tǒng)中，利用其軟件架構(gòu)同時控制顯微鏡和激光。 相干公司利用其為制造 24/7 環(huán)境設(shè)計的高功率光纖激光器的制造經(jīng)驗，意識到 AOM 方法在尺寸、成本、速度和整體性能方面的優(yōu)勢也將滿足雙光子成像應(yīng)用的要求。 無論是先進的神經(jīng)科學(xué)應(yīng)用還是醫(yī)學(xué)診斷應(yīng)用，通過將 AOM 的復(fù)雜控制集成到 Discovery NX、Axon 和 Monaco 的激光軟件和硬件架構(gòu)中，雙光子用戶(自制者和顯微鏡公司)可以從較大簡化且易于控制的光學(xué)裝置中受益。

審核編輯 黃宇