1.“合成生物”是什么？

合成生物其實(shí)就是一種“造物”的技術(shù)。它融合了生物學(xué)、化學(xué)和工程學(xué)等多種技術(shù)，以可再生生物質(zhì)為原料，以生物體作為生產(chǎn)介質(zhì)，旨在利用廉價(jià)原料，以菌群、細(xì)胞和酶為制造工廠，規(guī)模化發(fā)酵獲得目標(biāo)產(chǎn)品，具有清潔、高效和可再生等特點(diǎn)。

以透明質(zhì)酸（玻尿酸）為例。最初，透明質(zhì)酸取自牛的眼睛，價(jià)格非常昂貴。但通過生物合成技術(shù)，相較于傳統(tǒng)的化學(xué)技術(shù)，既安全環(huán)保，成本又低，真正實(shí)現(xiàn)了科技改變生活。合成生物學(xué)，蘊(yùn)含著“一切皆可合成”的潛能，隱藏著解鎖新質(zhì)生產(chǎn)力的密碼，也是目前從海外到國內(nèi)最火的未來產(chǎn)業(yè)新賽道之一。如江南大學(xué)團(tuán)隊(duì)利用合成生物學(xué)技術(shù)，借助微生物發(fā)酵生產(chǎn)普通分子量的透明質(zhì)酸，把成本降到每公斤幾百元，實(shí)現(xiàn)了透明質(zhì)酸大產(chǎn)量推廣應(yīng)用。團(tuán)隊(duì)通過人工合成方法，對現(xiàn)有的、天然存在的生物系統(tǒng)進(jìn)行重新設(shè)計(jì)和改造，甚至創(chuàng)造出自然界不存在的“生物結(jié)構(gòu)”，大大提高了產(chǎn)量。

2.合成生物學(xué)表型測試生物反應(yīng)器有哪些？

合成生物學(xué)經(jīng)過多年的發(fā)展，形成了典型的細(xì)胞工廠創(chuàng)制“設(shè)計(jì)-構(gòu)建-測試-學(xué)習(xí)”（design-build-testlearn， DBTL） 循環(huán)，成為支撐面向加速生物制造發(fā)展的智慧生物育種的重要方法。其中，測試環(huán)節(jié)是對前期所設(shè)計(jì)與構(gòu)建的生物體系進(jìn)行表型測試，以提供大量數(shù)據(jù)用于后續(xù)的學(xué)習(xí)和迭代升級。測試階段的通量主要依賴于細(xì)胞自身或其培養(yǎng)測試所使用的生物反應(yīng)器及其裝備，是整個(gè)DBTL流程的限速步驟。本文系統(tǒng)綜述了合成生物學(xué)表型測試所開發(fā)的面向不同通量的生物反應(yīng)器及裝備，從單細(xì)胞檢測和篩選及不同尺度生物反應(yīng)器包括皮納升級生物反應(yīng)器、微升級生物反應(yīng)器、毫升級生物反應(yīng)器和升級生物反應(yīng)器等。

在DBTL循環(huán)的表型測試環(huán)節(jié)中，針對不同應(yīng)用目標(biāo)和不同通量需求的測試，生物反應(yīng)器成為主要的表型研究工具，比如單細(xì)胞檢測篩選技術(shù)、基于多孔板的高通量篩選技術(shù)以及基于微流控的高通量篩選技術(shù)。

1）單細(xì)胞分選法

單細(xì)胞篩選是指根據(jù)細(xì)胞自身的特征，如細(xì)胞的形狀、密度、大小、光信號、圖像特征等進(jìn)行篩選。單細(xì)胞懸滴法則是根據(jù)液滴重力或微泵將包含單個(gè)細(xì)胞的液滴分配到目標(biāo)基板（如微孔板）上，而非目標(biāo)液滴則被轉(zhuǎn)移至廢液收集瓶中，分選過程溫和，但速度受限。此外，近年來有許多研究在微流控芯片上設(shè)計(jì)了許多微結(jié)構(gòu)以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞或粒子的主動(dòng)分選，包括微井結(jié)構(gòu)陣列單細(xì)胞捕獲、確定性橫向位移 （deterministic lateral displacement， DLD）和慣性流系統(tǒng)（inertial microfluidic），可基于單個(gè)細(xì)胞的直徑大小和彈性對大量細(xì)胞進(jìn)行快速高通量分選，且無需對細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記檢測即可實(shí)現(xiàn)目標(biāo)細(xì)胞分離。

圖1單細(xì)胞檢測與分選裝置工作原理圖

2）皮納升級微型生物反應(yīng)器

皮納升級生物反應(yīng)器體積范圍 1 pL～100 nL，主要包括兩種類型：一種是采用微加工技術(shù)在基板上制作微孔陣列，微孔直徑常小于500 μm，細(xì)胞裝入微孔中進(jìn)行培養(yǎng)和檢測，基于

微孔的單細(xì)胞篩選的通量約為102～103個(gè)；另一種是基于微液滴的生物反應(yīng)器，它是由液滴微流控技術(shù)產(chǎn)生的，將細(xì)胞封裝在液滴中進(jìn)行培養(yǎng)和檢測，液滴直徑常小于 200 μm，基于微液滴的單細(xì)胞篩選技術(shù)的通量為105～108個(gè)。這些皮納升規(guī)模的生物反應(yīng)器相對于大型生物反應(yīng)器可以有效提高細(xì)胞生長的初始濃度，為單細(xì)胞提供非競爭性的生長空間 ，更有利于細(xì) 胞的生長和代謝。

液滴微流控是指通過油相和水相在微流控芯片中進(jìn)行相互剪切，形成大規(guī)模的均勻液滴群，這些液滴直徑常小于 300 μm，在微生物學(xué)高通量單細(xì)胞培養(yǎng)和分析方面已顯示出其獨(dú)特優(yōu)勢。微液滴具有通量高、體積小、易操作、傳質(zhì)傳熱迅速等特點(diǎn)，已日益成為單細(xì)胞分析的重要工具，其應(yīng)用包括聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）、細(xì)胞培養(yǎng)、分選、分離、克隆形成、細(xì)胞裂解、基因和蛋白質(zhì)表達(dá)、抗體分泌以及細(xì)胞毒性分析研究。在微生物學(xué)領(lǐng)域，液滴通常是指油包水（Water-in-Oil， W/O）結(jié)構(gòu)的微液滴，可以很容易地通過主動(dòng)和被動(dòng)的液滴生成技術(shù)制備。單細(xì)胞培養(yǎng)的液滴大小從皮升到納升不等，由于細(xì)胞在生成液滴過程中是隨機(jī)分配到液滴內(nèi)的，被包裹在液滴中的細(xì)胞數(shù)量及其分布概率服從泊松分布統(tǒng)計(jì)學(xué)規(guī)律，這與有限稀釋方法類似。為了提高單細(xì)胞包封率，研究人員利用慣性流體技術(shù)或介電泳技術(shù)對芯片上液滴生成單元上游的細(xì)胞進(jìn)行排序，并控制其逐一進(jìn)入液滴，使得單細(xì)胞包封率可提高至 80% 以上。液滴形成后，可將液滴群儲存在小容器中，如離心管、微管或其他自制容器中，然后放置在合適的溫度、濕度和氣體環(huán)境中進(jìn)行孵育，微生物可在液滴中進(jìn)行增殖和代謝?？紤]到不同微生物種類需要不同的氧氣濃度，研究人員采用高透氣性微管路來儲存液滴，氧氣和二氧化碳可以通過管壁不斷滲透到油相中，或者對油相進(jìn)行反復(fù)充氧，使其給液滴供氧。

液滴的檢測與流式細(xì)胞術(shù)類似，其檢測信號包括熒光、拉曼、圖像、光散射、阻抗、核磁、電化學(xué)、質(zhì)譜和光吸收度等。對于液滴分選，與單細(xì)胞分選方式類似，仍然可以利用電場、磁場、光場、聲場、重力場、流體動(dòng)力場所產(chǎn)生的力來驅(qū)動(dòng)液滴到收集或廢液通道。通過上述檢測方式和分選方式的組合集成，可以實(shí)現(xiàn)高通量、高效率的微生物檢測與篩選。在皮納升微液滴反應(yīng)器中，較為廣泛使用的裝置是熒光激活液滴分選系統(tǒng)（fluorescence activated droplet sorting，F(xiàn)ADS）。其是將液滴熒光檢測和介電泳分選方式進(jìn)行集成設(shè)計(jì)，檢測到液滴熒光信號后，如果是感興趣的目標(biāo)液滴，則在微流控芯片下游用介電泳所產(chǎn)生

的驅(qū)動(dòng)力推動(dòng)至收集通道中，完成液滴的檢測分選，該技術(shù)平臺在微生物高通量篩選和酶進(jìn)化領(lǐng)域已經(jīng)獲得了廣泛應(yīng)用，有較多的相關(guān)文獻(xiàn)綜述報(bào)道。

圖2基于皮納升微液滴的單細(xì)胞表型測試與篩選

3.微流控技術(shù)在合成生物學(xué)的應(yīng)用前景展望

液滴微流控技術(shù)具有操作容易、通量高、液滴培養(yǎng)數(shù)字化和易自動(dòng)化等特點(diǎn)，是適于合成生物學(xué)高通量表型測試的頗具廣泛應(yīng)用前景的方法。商業(yè)化的裝備系統(tǒng)體積小、運(yùn)行成本低、使用和維護(hù)方便，越來越受到廣大科研人員和工程技術(shù)人員的關(guān)注，成為合成生物學(xué)發(fā)展的智慧平臺。目前，液滴微流控技術(shù)仍處于產(chǎn)業(yè)化上升期，雖然已有部分技術(shù)實(shí)現(xiàn)了產(chǎn)業(yè)化推廣，但如何進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)微液滴的高度穩(wěn)定、提升液滴通量的精準(zhǔn)可控性、實(shí)現(xiàn)微液滴裝備的創(chuàng)新定制化以及液滴操作的標(biāo)準(zhǔn)化和自動(dòng)化等方面仍然存在大量的基礎(chǔ)科學(xué)和工程科學(xué)問題需要深入研究。另外，需要發(fā)展更多適用于不同尺度液滴體系的表型測試傳感器，顯著提升表型表征能力，構(gòu)建更多維度的基因型-表型模型，為液滴微流控技術(shù)在DBTL循環(huán)中的應(yīng)用提供更強(qiáng)大的使能工具，最終實(shí)現(xiàn)開發(fā)國產(chǎn)替代高通量自動(dòng)化合成生物設(shè)施平臺，突破我國生物技術(shù)裝備研發(fā)能力弱、自主創(chuàng)新設(shè)備欠缺等“卡脖子”問題，加速我國合成生物技術(shù)原始創(chuàng)新步伐，支撐綠色生物經(jīng)濟(jì)的高質(zhì)量發(fā)展。

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審核編輯 黃宇