近期，中國科學(xué)院廣州健康院張驍研究員團隊提出一種基于結(jié)構(gòu)微流體創(chuàng)新的譜系細胞單克隆自動化獲取策略，以無標記、無酶活反應(yīng)參與、非侵入式的方式，在體細胞重編程過程出現(xiàn)的復(fù)雜譜系中實現(xiàn)了對特定譜系的單克隆性細胞的自動化獲取，并研發(fā)出基于結(jié)構(gòu)微流體的細胞單克隆獲取整機技術(shù)（圖1）。

圖1 自動化譜系細胞培養(yǎng)/及單克隆獲取整機技術(shù)概要

該原創(chuàng)性策略被部署于廣州健康院前期自主研發(fā)的自動化干細胞誘導(dǎo)培養(yǎng)裝備，提高了人誘導(dǎo)多能干細胞（hiPSCs）單克隆的獲取效率與純度，提升了系統(tǒng)魯棒性（robustness）及縮短了體細胞重編程后持續(xù)純化hiPSCs（sub-cloning）的建系周期。相關(guān)研究成果以“Selecting Monoclonal Cell Lineages from Somatic Reprogramming Using Robotic-Based Spatial-Restricting Structured Flow”為題發(fā)表在Research期刊上。

盡管譜系節(jié)點細胞在再生醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用前景廣闊，但基于傳統(tǒng)人為操作獲取譜系細胞單克隆的方法需要消耗大量時間和勞動力，獲取效率通常比較低，且無法以無標記、無酶活反應(yīng)參與、非侵入式的方式獲取譜系細胞單克隆。此外，利用微流控技術(shù)雖然可以提高譜系細胞收獲效率，但這種方法無法獲得基于譜系特異性的細胞單克隆。因此，發(fā)展能夠高效富集譜系細胞單克隆的自動化整機技術(shù)顯得尤為重要。

細胞-細胞/細胞-基質(zhì)之間的粘附力變化是譜系細胞命運變化中的一個關(guān)鍵環(huán)節(jié)，通過調(diào)節(jié)流體剪切力大小可以實現(xiàn)以無標記、無酶活反應(yīng)參與、非侵入式的方式分離/選擇具有不同粘附特性的譜系細胞單克隆，這種策略可以應(yīng)用于基于細胞類型特異性的單克隆工程化獲取。張驍研究員團隊前期研究中利用AI算法實現(xiàn)了對重編程細胞單克隆的識別和預(yù)測，并將AI技術(shù)應(yīng)用于生命科學(xué)儀器整機技術(shù)研究。該團隊在前期依托中國科學(xué)院廣州健康院研發(fā)出了具有自主知識產(chǎn)權(quán)的自動化干細胞誘導(dǎo)培養(yǎng)設(shè)備，憑借這些研究背景，結(jié)合整機技術(shù)和分子組織生物學(xué)認知以及空間結(jié)構(gòu)微流體操控技術(shù)，該團隊研發(fā)了自動化整機，通過以編程的方式精確操控結(jié)構(gòu)微流體，并產(chǎn)生具有空間定位的流體剪切力，實現(xiàn)在復(fù)雜高異質(zhì)性的細胞環(huán)境中通過流體變化選擇特定的細胞類型，并實現(xiàn)譜系細胞單克隆的特異性獲取。

通過分析不同體細胞重編程過程中細胞粘附分子的表達水平變化情況，研究人員發(fā)現(xiàn)細胞多能性基因的表達水平與Integrin家族基因的表達量呈負相關(guān)性，而與Cadherin家族基因的表達量呈正相關(guān)性。由于Integrins是細胞與細胞外基質(zhì)（ECM）相互作用的關(guān)鍵粘附分子，而Cadherins是細胞與細胞之間相互連接的重要分子，這意味著體細胞重編程轉(zhuǎn)變成多能干細胞這一譜系命運變化過程中，細胞與ECM的連接可能會減弱，而細胞與細胞之間的連接可能會增強。為了證明這個假設(shè)，張驍研究員提出進一步通過設(shè)計平行平板流動腔實驗和免疫熒光實驗來進行驗證。實驗結(jié)果與預(yù)期假設(shè)相一致，并且平行平板流動腔實驗初步證明了流體剪切力有望成為分離/選擇特定類型粘附細胞的好技術(shù)路徑（圖2）。

圖2體細胞重編程中細胞譜系命運變化伴隨著粘附分子表達的改變，流體剪應(yīng)力可用于分離粘附細胞

隨后，論文第一作者陳學(xué)平博士基于流體動力學(xué)原理設(shè)計了可以產(chǎn)生局部結(jié)構(gòu)微流體的細胞獲取微型挑針結(jié)構(gòu)（PTMS），團隊克服了流場效果與多曲面加工實現(xiàn)的難題，反復(fù)校驗加工結(jié)構(gòu)，最終基于PTMS產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)微流體（PTMS-FLOW）實現(xiàn)了對基于空間限位譜系細胞的特異性挑取。此外，研究證明了PTMS-FLOW可根據(jù)流速變化在Z軸-h0的為常量的條件下，應(yīng)對不同細胞類型的粘附力差異，實現(xiàn)以無標記、無酶活反應(yīng)參與、非侵入式、和非接觸的方式對不同譜系細胞進行特異性的選擇。該研究證明了結(jié)構(gòu)微流體是作為分離/選擇特定譜系類型粘附細胞的可自動化的技術(shù)路徑，為后續(xù)進一步研究譜系細胞單克隆的自動化獲取提供了理論基礎(chǔ)（圖3）。

圖3 基于空間定位的結(jié)構(gòu)微流體研究不同譜系細胞的粘附分離作用

為了將上述策略應(yīng)用于對體細胞重編程過程中特定譜系的細胞的自動化獲取，研究團隊通過克服機械模塊控制和精準調(diào)度的難題，結(jié)合細胞光學(xué)成像和自適應(yīng)算法，實現(xiàn)精準操控微結(jié)構(gòu)的功能底部與細胞單克隆之間的Z軸間距和水平位移，從而確保精準操控PTMS-FLOW作用于單克隆性的譜系細胞上，以此實現(xiàn)在體細胞重編程過程出現(xiàn)的復(fù)雜譜系中快速獲取hiPSCs細胞單克隆的目標（圖4）。

圖4 研發(fā)自動化譜系細胞培養(yǎng)/及單克隆獲取整機技術(shù)

此外，研究團隊借助自動化整機技術(shù)的精確的流體操控能力，設(shè)計了一種雙挑模式（Dual Run Selection），通過使用兩次不同強度的剪切流體分別獲取不同類型粘附特性的譜系細胞，實現(xiàn)了對特定空間位置的hiPSCs譜系細胞單克隆的特異性選擇（圖5），并能為下游hiPSCs實現(xiàn)特異性擴增提供純化（sub-cloning）能力。

圖5 基于譜系細胞粘附力的差異，應(yīng)用PTMS-FLOW實現(xiàn)了對重編程多能干細胞單克隆的選擇

綜上所述，研究團隊提出一種基于微型挑針結(jié)構(gòu)介導(dǎo)的PTMS-FLOW實現(xiàn)了以無標記、無酶活反應(yīng)參與、和非侵入式的方式快速獲取譜系細胞單克隆的目標，并研發(fā)出具有自主知識產(chǎn)權(quán)的譜系細胞單克隆自動化獲取的整機技術(shù)。該整機技術(shù)通過大幅減少譜系細胞生成過程中的時間成本，以及人工操作量，使得譜系細胞獲取和培養(yǎng)起來更簡單。該研究為自動化生產(chǎn)特定譜系細胞用于臨床干預(yù)提供了新的技術(shù)方案，并為再生醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究提供更多自動化獲取譜系細胞的工具，從而從技術(shù)手段和方法學(xué)方面促進再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的基礎(chǔ)研究和應(yīng)用落地。

論文鏈接：

https://doi.org/10.34133/research.0338