熒光的共定位是當(dāng)今生物顯微成像中一個極為常見的技術(shù)，兩個或者更多種不同顏色的熒光探針被用來標(biāo)記不同的結(jié)構(gòu)/位點，使得其相互關(guān)系得以明晰地在合并的圖像上展現(xiàn)。隨著研究者對于實驗的要求越來越高，這些熒光共定位的成像逐漸被希望能用于熒光強度高速變化或者樣品本身位置不斷變化的實驗中，比如活動的斑馬魚、線蟲體內(nèi)兩類神經(jīng)細(xì)胞的熒光共定位成像。在這些實驗中，由于樣品本身是運動的，兩個顏色的成像時間間隔越短，越能夠反映熒光探針共定位的真實情況。

在另外一些實驗中，同一個熒光探針的熒光顏色(波長)會隨著環(huán)境的變化而發(fā)生變化，那么前后兩種顏色熒光強度的比值就能反映出環(huán)境的變化，如Di4之于細(xì)胞膜電位，Cameleon之于Ca離子濃度等等。當(dāng)相關(guān)的環(huán)境變化速度比較快的時候，兩個顏色的成像時間間隔越短，測量也就越精確。

綜合以上兩類成像實驗，均是需要盡可能地將兩個不同顏色熒光信號在同一時刻拍攝下來，那么最理想的情況就是我們在這篇Application notes中所提到的雙色同步成像，即完全同時地拍攝兩個顏色通道的熒光信號。

雙色同步成像——采用W-View GEMINI的完全同步成像

雙色同步成像最直接的思路就是用彩色相機，但如今絕大多數(shù)的彩色相機是在黑白芯片的基礎(chǔ)上將每個像素前添加濾光涂層(一般為紅、綠、藍(lán)三種，如下圖)，此彩色濾光涂層使得不同的像素可以分別得到不同的顏色信息，最后合成出彩色的圖片。這樣的設(shè)計在明場成像(如HE染色，免疫組化切片)中不可或缺，但對于生物熒光信號的成像卻是有缺陷的。首先，濾光涂層的出現(xiàn)會吸收或反射部分入射光信號，降低整個芯片的靈敏度，在信號本來就較弱的熒光拍攝中會影響到成像信噪比;其次，由于不同像素前存在不同顏色的濾光涂層，對于單色光信號——比如熒光信號——的實際分辨率將被降低。換句話說，對于一臺140萬像素的彩色CCD相機，其真正能夠檢測到綠色熒光信號的像素僅有約70萬個像素，其余的70萬像素的綠光強度信息均為計算獲得(注：因為綠色為人眼最為敏感的顏色，所以一般彩色相機中以4個像素為一組，兩個像素采用綠色涂層，其余兩個像素則分別采用藍(lán)色及紅色涂層)。更重要的，如果采用這類彩色相機用于雙色熒光同步成像，一些顏色并不是紅綠藍(lán)三種顏色(對應(yīng)彩色相機像素上的三種濾光涂層)的熒光探針將受到極大的限制。

所以傳統(tǒng)上，許多實驗室通過切換顯微鏡上的濾光塊轉(zhuǎn)盤或者是采用濾光輪進行不同顏色之間的切換。但這樣無法做到完全同步拍攝兩個顏色的圖片，濾光塊轉(zhuǎn)盤的切換時間需要約1秒鐘，而濾光輪不同濾光片之間的每一次切換也需要幾十毫秒時間，事實上影響了實驗的時間分辨率，所以在比較高速的比例成像等場合，采用濾光輪或者濾光塊轉(zhuǎn)盤都容易造成數(shù)據(jù)的誤差。

而采用濱松W-View GEMINI則完全沒有這樣的擔(dān)心，兩個顏色的信號被成像到相機的上下兩半感光芯片上，實現(xiàn)了兩個顏色成像的完全同步。

雙色同步成像——一臺Flash 4.0 LT相機作兩臺用

采用W-View GEMINI這樣的雙色分光附件將兩種顏色的信號成像到一臺相機的一個感光芯片上很好地解決了同步成像的時間問題，但對于絕大多數(shù)的相機，整個感光芯片只能設(shè)置一個曝光時間，當(dāng)兩個顏色的信號強度相差較大時將很難同時將兩個顏色的成像信噪比保證在最佳狀態(tài)。

而濱松Flash 4.0 LT則可以分別調(diào)整同一芯片上下兩半的曝光時間。所以在采用W-View GEMINI配合Flash 4.0 LT的時候，我們可以非常靈活地調(diào)整兩個顏色信號的相對亮度，得到更加能夠突出所需信號和結(jié)構(gòu)的圖片。在兩個顏色通道的信號差別非常大的時候，F(xiàn)lash 4.0 LT + W-View GEMINI這種靈活的曝光時間設(shè)置就可以針對不同的波長設(shè)置不同的曝光時間，同時保證兩個波長信號的信噪比。

審核編輯 黃宇