根據(jù)世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）的數(shù)據(jù)，全球45%的疾病負擔是由生物負荷造成的。在生物制藥的生產(chǎn)中，與生物負荷有關(guān)的污染也是一個主要問題。因此，快速和準確的生物負荷檢測在食品、衛(wèi)生、制藥和環(huán)境應(yīng)用中變得越來越必要。

近幾十年來，微流控技術(shù)已成為一項強大的技術(shù)，并在分析化學、制藥、化學合成和臨床應(yīng)用等幾個前沿研究領(lǐng)域得到了應(yīng)用。近年來，微流控技術(shù)也被應(yīng)用于微生物研究。微流控器件具有微米級特征尺度和大規(guī)模集成的特點，在微生物分析和抗生素持久性研究方面具有低成本、高通量和高效率等特殊優(yōu)勢。隨著微流控技術(shù)的發(fā)展，一些研究利用濾紙作為捕獲和檢測細菌的手段，并且由于其低成本、易于獲取、加工和修飾，以及可拋性而變得流行。

然而，已報道的基于濾紙的微流控器件具有很高的檢測限（LOD，57 CFU/m ~ 500 CFU/mL），并且精度較低。此外，濾紙基微流控器件通常需要復雜的修飾（抗體功能化），即將納米顆粒固定化，并利用紫外線將濾紙上用于檢測的圖案光固化。同時，由于經(jīng)過特定抗體功能化，濾紙基微流控器件通常對特定細菌菌株的檢測具有特異性。這些缺點阻礙了快速、簡便、低成本的濾紙基微流控器件在細菌檢測，特別是在現(xiàn)場檢測中的廣泛應(yīng)用。

據(jù)麥姆斯咨詢報道，近期，為了準確、高靈敏度地檢測生物負荷，來自美國馬里蘭大學巴爾的摩分校（University of Maryland Baltimore County）的研究人員制造了一種新型的微流控器件，該器件集成了濾紙，以用于細胞捕獲。同時，該器件利用熒光標記的間苯二酚的氧化還原反應(yīng)在濾紙上原位檢測生物負荷，并使用便攜式多通道熒光計進行熒光測量。此外，該微流控器件采用微波誘導熱輔助鍵合技術(shù)進行制備，具有制備簡便、成本低和速度快的優(yōu)勢。

圖1 （a）集成相應(yīng)厚度濾紙的微流控器件的不同層；（b）由不同組件鍵合而成的微流控器件（左）以及具有刃天青樣品的微流控器件（右）的照片

研究人員首先探索了不同材料和尺寸的濾紙，并優(yōu)化了相關(guān)參數(shù)，以獲得更高的熒光信號和實現(xiàn)更靈敏的生物負荷檢測。

圖2 匹配不同直徑圓孔的聚醚砜（PES）濾紙的熒光響應(yīng)

芽孢桿菌是一種廣泛存在的革蘭氏陽性細菌，對人類、植物和其它生物有害，并會引起嚴重的傳染病。因此，研究人員利用該微流控器件對培養(yǎng)的原代枯草芽孢桿菌樣品進行過濾，以此驗證并考察其性能參數(shù)。研究結(jié)果表明，與金標準熒光測量裝置分光光度計和在多通道熒光儀中的普通微流控試劑盒（C）相比，該集成濾紙的微流控試劑盒（CF）具有更高的靈敏度和更低的檢測限（0.037 CFU/mL）。

圖3 （a）不同細菌樣品在具有集成濾紙的微流控試劑盒的熒光儀中的響應(yīng)；（b）5 CFU/mL細菌樣品在具有兩種不同微流控試劑盒的熒光儀中以及在分光光度計中的響應(yīng)

圖4 （a）不同細菌樣品在具有集成濾紙的微流控試劑盒（CF）和普通微流控試劑盒（C）的熒光儀中以及在具有96孔板的分光光度計中的熒光斜率；（b）計算出的在熒光儀中的集成濾紙的微流控試劑盒（CF）和普通微流控試劑盒（C）以及在分光光度計中的96孔板的檢測限和靈敏度

此外，該微流控器件的檢測限還可以通過增大過濾體積來提高。從圖5中可以看出，隨著微流控器件過濾體積的增大，熒光強度和斜率顯著增加。這種增加反過來又增強了帶有熒光計的微流控器件的靈敏度，如圖5b所示。

圖5 （a）不同過濾體積的5 CFU/mL的芽孢桿菌在具有微流控試劑盒的熒光儀中的響應(yīng)；（b）隨著過濾體積的增大，微流控器件靈敏度的變化

另外，利用該微流控器件和檢測方法，研究人員可以在實驗室培養(yǎng)的樣品孵育后6小時內(nèi)檢測到細菌，比金標準培養(yǎng)方法減少了至少4倍的檢測時間。在孵育后，樣品注入的時間取決于注入體積，最快只需要一分鐘，并且可以很容易地完成。而其它細菌檢測程序，如聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）、酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）和細菌培養(yǎng)方法，均需要一定的程序、技術(shù)準備和極其清潔的操作區(qū)域，這些操作更復雜，需要訓練有素的人員才能完成。這就是該微流控器件在檢測超低水平生物負荷上優(yōu)于其它傳統(tǒng)方法的所在。此外，該研究所開發(fā)的微流控器件的成本約為1.6美元/個，而8通道熒光計的成本約為1300美元，其成本可以通過擴大生產(chǎn)進一步降低，并且與傳統(tǒng)儀器相比具有成本效益。

總體而言，這種新型的微流控器件和熒光儀一起可以作為一種快速便攜式工具，用于不同應(yīng)用場景下的高靈敏度、準確和高通量的細菌檢測。

審核編輯：劉清