PCR概述

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction, PCR)是一種在體外模擬DNA復(fù)制過程，擴(kuò)增少量的DNA片段，從而獲得足夠數(shù)量的DNA樣本用于進(jìn)一步研究的常見的分子生物學(xué)技術(shù)。該技術(shù)由美國的Kary Mullis在1983年發(fā)明，由于高度特異性和靈敏度，PCR被廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究、疾病診斷、農(nóng)業(yè)檢測和法醫(yī)鑒定等領(lǐng)域，而Kary Mullis也因這一發(fā)明獲得了1993年的諾貝爾化學(xué)獎。

PCR技術(shù)主要包含3個反應(yīng)步驟

01 變性

模板DNA在高溫下（通常為93~94℃）變性，原來的DNA雙鏈解離成單鏈；

02 退火

反應(yīng)體系的溫度降至50-65℃時，引物與單鏈互補(bǔ)結(jié)合；

03 延伸

在耐熱的DNA聚合酶作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，合成新鏈；

PCR技術(shù)原理示意圖

PCR分類

隨著PCR技術(shù)的不斷發(fā)展，在PCR技術(shù)原理的基礎(chǔ)上衍生出了多樣的PCR技術(shù)，目前常用的PCR技術(shù)主要包括以下幾類：

常規(guī)PCR

最原始和簡單的PCR方法，在PCR反應(yīng)結(jié)束之后，通過凝膠電泳等方式分析PCR擴(kuò)增終產(chǎn)物，此方法無法監(jiān)測反應(yīng)過程，只能在反應(yīng)結(jié)束后借助電泳得到結(jié)果；

逆轉(zhuǎn)錄PCR

又稱RT-PCR，這是一種從mRNA逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA并擴(kuò)增的技術(shù)。要進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄PCR，需要先提取總RNA，以mRNA為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成cDNA，再以此cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。逆轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)靈敏且應(yīng)用廣泛，可用于檢測細(xì)胞中基因表達(dá)水平，細(xì)胞中RNA病毒含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。

RT-PCR技術(shù)原理示意圖

實時熒光定量PCR

又稱qPCR或者Real-Time PCR，是指在PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系中加入熒光染料或熒光基團(tuán)，通過收集熒光信號實時監(jiān)測擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線和Ct值對待測樣品進(jìn)行定量分析。qPCR常用的方法包括熒光染料法和熒光探針法。

qPCR的熒光染料法和熒光探針法原理示意圖

PCR常見問題

在進(jìn)行PCR實驗時，可能會遇見以下常見問題：

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MyGo系列實時定量PCR儀

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審核編輯黃宇