新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）是由國際病毒分類委員會指定的“嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合征冠狀病毒2型”病毒（SARS-CoV-2）引起的。由于這種病毒具有高度傳染性，可導(dǎo)致嚴(yán)重的呼吸道疾病，進(jìn)而引起死亡，世界衛(wèi)生組織（WHO）于2020年3月11日將COVID-19疫情列為大流行。在大流行中，提供快速、準(zhǔn)確和便捷的診斷方法來檢測感染和監(jiān)測免疫反應(yīng)，對于治療、減輕、控制和管理疾病的傳播至關(guān)重要。

目前，用于檢測和監(jiān)測SARS-CoV-2感染的主要實(shí)驗(yàn)室診斷工具可分為以下幾類：（1）識別病毒RNA的工具；（2）檢測病毒抗原的工具；（3）檢測病毒感染時體液反應(yīng)中產(chǎn)生的抗體的工具。其中，利用實(shí)時逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測病毒RNA是診斷活動性感染的金標(biāo)準(zhǔn)。然而，該技術(shù)容易受到樣本處理問題和病毒突變的影響，從而可能分別導(dǎo)致假陽性和假陰性的檢測結(jié)果。而抗原檢測是通過對病毒中存在的蛋白質(zhì)（如N和S蛋白）進(jìn)行免疫檢測，以確定活動性感染?；趥?cè)向流動檢測的快速抗原檢測因具有易于使用、價(jià)格低廉、可在5-30分鐘內(nèi)提供檢測結(jié)果的優(yōu)勢，已成為COVID-19即時診斷的代名詞。然而，與RT-PCR相比，快速抗原檢測的靈敏度較低。

與以上兩種方法對應(yīng)，抗體或血清學(xué)檢測方法用于檢測人體內(nèi)是否存在SARS-CoV-2抗體。由于抗體是由免疫系統(tǒng)的B細(xì)胞對病毒感染做出反應(yīng)而產(chǎn)生的，陽性的血清學(xué)檢測結(jié)果表明人體在過去或當(dāng)下受到了病毒感染。此外，這些檢測可以幫助減少假陽性和假陰性檢測結(jié)果的數(shù)量，是病毒RNA和病毒抗原檢測的重要補(bǔ)充。事實(shí)上，血清學(xué)檢測相比病毒RNA和抗原檢測有一些優(yōu)勢，比如檢測窗口更長；并且與病毒RNA相比，人體抗體更穩(wěn)定；另外，采集血液比采集呼吸道樣本更安全；同時，血液中的抗體比呼吸道樣本中的病毒分布更均勻；且血清學(xué)檢測不需要在生物安全二級（BSL-2）實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。此外，抗體檢測在診斷涉及病毒RNA檢測陰性或無癥狀感染的疑似病例以及在群體水平進(jìn)行接觸者追蹤、疫情發(fā)展監(jiān)測、病毒來源追蹤和流行病學(xué)評估等方面發(fā)揮著重要作用；這些檢測還在監(jiān)測免疫反應(yīng)以評估免疫的進(jìn)程、程度和持久性，確定處于康復(fù)期的潛在獻(xiàn)血人員，開發(fā)和評估治療性抗體，以及開發(fā)和評估疫苗方面發(fā)揮作用。

據(jù)麥姆斯咨詢報(bào)道，近期，來自加拿大阿爾伯塔大學(xué)（University of Alberta）的研究人員于Microsystems & Nanoengineering期刊發(fā)表了題為“Label-free impedimetric immunosensor for point-of-care detection of COVID-19 antibodies”的論文，提出了一種基于叉指微電極陣列（IMA）的阻抗免疫傳感器，用于檢測和監(jiān)測人體血清中的SARS-CoV-2抗體。該傳感器利用化學(xué)偶聯(lián)反應(yīng)將SARS-CoV-2的刺突蛋白（S蛋白）功能化并共價(jià)固定在IMA表面，作為識別層，以特異性結(jié)合抗刺突抗體。而抗體與識別層S蛋白的結(jié)合將導(dǎo)致電容增加，從而引起傳感系統(tǒng)阻抗的變化。

圖1 叉指微電極陣列（IMA）表面功能化和刺突蛋白固定化示意圖

其中，該基于電化學(xué)阻抗譜（EIS）的生物傳感器中的檢測信號可以來自法拉第過程或非法拉第過程。在基于法拉第過程的生物傳感器中，由于系統(tǒng)中氧化還原試劑的氧化還原反應(yīng)，檢測信號來自IMA上的界面電荷轉(zhuǎn)移反應(yīng)。在這個過程中，氧化還原試劑是必需的，同時傳感系統(tǒng)中的輸入電壓必須高于氧化還原試劑的氧化還原電位。而基于非法拉第過程的生物傳感器的檢測信號來自于IMA電極-溶液界面識別層中選擇性抗原-抗體結(jié)合導(dǎo)致的界面層電容和電阻的變化。因此，基于非法拉第過程的傳感系統(tǒng)是無標(biāo)記的，需要低無擾動電壓，因而適用于即時診斷（POC）應(yīng)用。

基于非法拉第過程傳感系統(tǒng)的檢測原理如圖1所示，當(dāng)IMA中的電極和電極間隙分別被巰基-十一醇（MUOH）和氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）功能化時，斯特恩（Stern）層和擴(kuò)散層通過形成自組裝單分子層（SAM）而被推離電極表面。SAM的進(jìn)一步功能化和隨后的刺突蛋白固定化導(dǎo)致識別層的形成，這使得傳感器能夠選擇性地結(jié)合和檢測COVID-19抗體。

眾所周知，電容式生物傳感器的靈敏度低于法拉第式生物傳感器。提高電容式生物傳感器靈敏度的一個巧妙方法是降低EIS測量中使用的溶液的離子強(qiáng)度。為了深入了解離子強(qiáng)度對器件靈敏度的影響，研究人員以檢測抗S蛋白抗體（IgG、IgM和IGA）為例，利用MUOH和APTES修飾的IMA，通過測量含有1 x PBS和0.001 x PBS的溶液中的阻抗來研究器件的性能。結(jié)果表明，當(dāng)在1 x PBS溶液中進(jìn)行阻抗測量時，該器件表現(xiàn)出相對較低的靈敏度；而在0.001 x PBS溶液中測得的低頻區(qū)檢測信號的幅值遠(yuǎn)大于在1 x PBS溶液中測得的相應(yīng)值。顯然，該結(jié)果表明，通過調(diào)節(jié)介質(zhì)的離子強(qiáng)度，可以顯著提高阻抗免疫傳感器的靈敏度，這與理論上預(yù)測的電場的距離依賴性一致。

圖2 無標(biāo)記生物傳感器對抗體與固定在阻抗免疫傳感器識別層上的三聚體刺突蛋白選擇性結(jié)合過程進(jìn)行基于非法拉第過程的EIS測量示意圖

圖3 生物傳感器靈敏度對用于非法拉第過程EIS測量的傳感介質(zhì)離子強(qiáng)度的依賴關(guān)系

此外，根據(jù)利用世界衛(wèi)生組織國際標(biāo)準(zhǔn)（WHO IS）制定的用于抗新冠病毒免疫球蛋白檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線測定的結(jié)果，該器件的檢測限（LOD）為0.4 BAU/ml，該LOD與所有已驗(yàn)證和已建立的商業(yè)檢測報(bào)告的相應(yīng)LOD（范圍為0.41 ~ 4.81 BAU/ml）相似。另外，這種概念驗(yàn)證型生物傳感器已被證明可以在1小時內(nèi)檢測到COVID-19感染者血清中的抗刺突抗體。

圖4 無標(biāo)記非法拉第EIS生物傳感器檢測新冠病毒抗體的標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)曲線及其與其他生物傳感器的性能比較

綜上所述，在這項(xiàng)工作中，研究人員開發(fā)了一種無標(biāo)記阻抗電容式免疫傳感器，該傳感器能夠清晰地區(qū)分COVID-19陽性和COVID-19陰性的人血清樣本，具有良好的靈敏度和特異性。該文介紹的非法拉第阻抗檢測采用低無擾動電壓，不需要標(biāo)記或添加傳感試劑，與ELISA不同，該方法不需要酶標(biāo)記的二抗、底物以及相應(yīng)的孵育時間。因此，無標(biāo)記阻抗免疫傳感器本質(zhì)上需要比ELISA更短的孵育時間，未來有望用于快速診斷檢測。

論文鏈接：
https://doi.org/10.1038/s41378-022-00460-5

審核編輯 ：李倩