使用傳統(tǒng)的硅-玻璃體系能夠以各種方式制備微流控芯片，易于硅加工和表面修飾，并且有利于后續(xù)應(yīng)用，例如細(xì)胞接種及相關(guān)研究。

目前，細(xì)胞的熒光成像成為研究細(xì)胞行為的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。不幸的是，硅流道底部的不均勻表面影響了通過(guò)濾光片的光穿透，致使微流控系統(tǒng)中的高靈敏度熒光成像（例如使用全內(nèi)反射熒光（TIRF）顯微鏡）出現(xiàn)問(wèn)題。

據(jù)麥姆斯咨詢報(bào)道，西北工業(yè)大學(xué)聯(lián)合捷克科學(xué)院（Czech Academy of Science）生物技術(shù)研究所（Institute of Biotechnology）及查理大學(xué)（Charles University）針對(duì)上述問(wèn)題做了進(jìn)一步研究，他們發(fā)現(xiàn)可以使用絕緣體上硅（SOI）襯底，通過(guò)頂部硅層的厚度定義流道深度，以及停止掩埋二氧化硅（SiO2）層的蝕刻來(lái)解決這一問(wèn)題。

如此，熒光背景信號(hào)下降到原來(lái)的五分之一，對(duì)應(yīng)的熒光素檢測(cè)限從?0.05毫摩爾提升到?50納摩爾。研究人員證明了使用基于全內(nèi)反射熒光的單分子檢測(cè)平坦表面的重要性，與傳統(tǒng)的硅晶圓相比，其信噪比提高了超18倍。

典型的熒光光學(xué)系統(tǒng)包括：光源、激發(fā)濾光片（XF，用于防止不需要的成分激發(fā)光并可能干擾結(jié)果）、二向色鏡（DM，又稱雙色鏡，用于在樣品上反射經(jīng)濾光的激發(fā)光），以及一個(gè)發(fā)射濾光片（MF，用于阻擋濾過(guò)的激發(fā)光），該系統(tǒng)只允許發(fā)射光通過(guò)光學(xué)探測(cè)器，該探測(cè)器可以是光電二極管、光電倍增管（PMT）或合適的相機(jī)。

研究人員使用了高端濾光片，ET系列型號(hào)49002（產(chǎn)自美國(guó)佛蒙特州貝洛斯福爾斯的Chroma Technology公司），用于異硫氰酸熒光素（FITC）型熒光。

（A）異硫氰酸熒光素（FITC）濾光片組透射圖，展示激發(fā)濾光片（藍(lán)色）、二向色鏡（紅色）和發(fā)射濾片（綠色）的特性；（B）使用異硫氰酸熒光素濾光片組的Stilla數(shù)字聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）芯片的熒光圖像

研究人員使用納米光刻工具箱設(shè)計(jì)微流控芯片（下圖A），它有16個(gè)帶有切向管連接的腔室，每個(gè)腔室的面積為15mm2，深度為?100μm，體積為1.5nL，并使用計(jì)算機(jī)輔助軟件可視化單個(gè)腔室（下圖B）。

他們使用傳統(tǒng)的微制造技術(shù)用于微流控芯片，包括使用兩個(gè)光刻步驟的圖案化硅襯底和陽(yáng)極鍵合到硅襯底的非圖案化玻璃蓋。

他們?cè)谄教挂r底上進(jìn)行了兩次光刻步驟，這對(duì)他們來(lái)說(shuō)，沒(méi)有任何挑戰(zhàn)。接著，他們使用博世（Bosch）工藝和基于六氟化硫（SF6）蝕刻和八氟異丁烯（C4F8）聚合物沉積結(jié)合的深反應(yīng)離子蝕刻（DRIE）。這是一種眾所周知的工藝，蝕刻速率極佳。

然后，他們使用陽(yáng)極鍵合對(duì)蝕刻的硅晶片進(jìn)行封蓋，因?yàn)椴ＡЩ迳蠜](méi)有圖案，這意味著不必遵守嚴(yán)格的對(duì)準(zhǔn)規(guī)則，這是一項(xiàng)容易的制造任務(wù)。

基于不同表面的微加工工藝展示

研究人員將兩個(gè)微流控芯片置于光學(xué)顯微鏡下，并捕獲了兩個(gè)硅襯底的暗場(chǎng)圖像，一個(gè)由傳統(tǒng)硅晶圓制成（下圖A1），另一個(gè)由SOI晶圓制成（下圖A2）。

他們觀察到了傳統(tǒng)硅晶圓制作的腔室底部的強(qiáng)光散射信號(hào)，而并沒(méi)有從基于SOI的腔室觀察到散射。正是這種散射導(dǎo)致了熒光的背景問(wèn)題

。他們使用基于配備50倍物鏡的Mireau干涉儀的白光光學(xué)剖面儀測(cè)量表面形貌?，使用垂直位移干涉模式（VSI）（下圖B1，B2）。硅襯底表面的粗糙度比SOI襯底大84倍。

（A）經(jīng)20倍物鏡暗場(chǎng)顯微鏡蝕刻后的傳統(tǒng)硅襯底表面圖像；（B）垂直位移干涉模式下SOI襯底（上）與標(biāo)準(zhǔn)硅晶圓襯底（下）的干涉圖像；（C）光電倍增管電壓作為熒光素濃度的函數(shù)，腔室材料類型為參數(shù)，縱軸和橫軸使用對(duì)數(shù)刻度；紅色表示傳統(tǒng)的硅襯底，黑色表示SOI襯底。

研究人員將熒光素溶液填充進(jìn)微流控芯片腔室，并將該溶液濃度從?1納摩爾改變至?100微摩爾，同時(shí)保持一個(gè)空腔作為參考，以確定每個(gè)芯片的熒光檢測(cè)限（LOD）。然后，他們測(cè)量了所有腔室的熒光振幅，并根據(jù)其繪制出熒光素濃度函數(shù)（上圖4C）。基于測(cè)量，由傳統(tǒng)硅襯底制成的微流控芯片的熒光檢測(cè)限高出約5倍。

在該文章中，研究人員分析了使用微流控芯片進(jìn)行單分子成像的高端濾光片的特性。

他們著重強(qiáng)調(diào)，結(jié)束微流控芯片的陽(yáng)極鍵合之前的最后一個(gè)制造步驟是硅熱氧化，硅熱氧化在900°C下干燥的氧氣（O2）環(huán)境中進(jìn)行，以生長(zhǎng)厚度為5nm的二氧化硅（SiO2）層，同時(shí)確定腔室表面特性。該環(huán)境中的這一步驟去除了可能附著在原始硅表面的所有微量化學(xué)物質(zhì)。

硅以及用于陽(yáng)極鍵合的玻璃都不顯示任何自熒光，并且硅和SOI這兩種不同襯底的微流控芯片之間的唯一區(qū)別是底部形貌，其余部分相同。因此，無(wú)論效果如何，根本原因是它與表面形貌有關(guān)，并且這種形貌的去除顯著改善了熒光測(cè)量（成像）特性。

研究人員發(fā)現(xiàn)，在使用硅襯底傳統(tǒng)技術(shù)制造微流控芯片時(shí)，由于與粗糙結(jié)構(gòu)的底部相關(guān)的各種可能的影響，高分辨率成像（如用于單分子運(yùn)動(dòng)測(cè)定的全內(nèi)反射熒光技術(shù)）并沒(méi)有達(dá)到預(yù)期的結(jié)果。他們研究了這一現(xiàn)象，并證明了用SOI襯底替代傳統(tǒng)硅襯底的解決方案，可保證微流控芯片的平坦底部，同時(shí)允許全內(nèi)反射熒光技術(shù)通過(guò)使用488nm波長(zhǎng)的照明來(lái)確定單分子運(yùn)動(dòng)性，從而最大限度地發(fā)揮其潛力。

昂貴的SOI晶圓可能會(huì)被傳統(tǒng)的硅晶圓取代，并允許通過(guò)合適的平滑技術(shù)（例如基于氫氟酸（HF）/硝酸（HNO3）蝕刻技術(shù)）進(jìn)行微流控腔室蝕刻。無(wú)論如何，與芯片制造相比，原始襯底的成本通常是相當(dāng)?shù)偷?，尤其是與包括單分子測(cè)試在內(nèi)的后續(xù)應(yīng)用相比，這證明了這種高襯底成本的合理性。

論文鏈接：

https://www.nature.com/articles/s41598-022-23426-z

審核編輯：劉清