神經(jīng)系統(tǒng)功能的維持需要消耗大量的ATP。線粒體通過氧化磷酸化產(chǎn)生ATP，是神經(jīng)元細(xì)胞能量的主要來源。由于神經(jīng)元軸突高度特化的結(jié)構(gòu)以及ATP在軸突中有限的擴(kuò)散能力，軸突線粒體的穩(wěn)態(tài)對于維持神經(jīng)元軸突的能量代謝與功能至關(guān)重要。在成熟的中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元中，軸突一旦受到急性損傷，軸突線粒體的功能與運(yùn)輸均出現(xiàn)異常，導(dǎo)致受損軸突局部面臨能量缺失的壓力，最終將導(dǎo)致軸突退化以及再生失敗。受限于研究方法，在動物模型中很難對損傷后軸突中的線粒體動態(tài)以及能量代謝變化進(jìn)行實(shí)時(shí)觀察。2005年Taylor等人報(bào)道了利用微流控芯片分離神經(jīng)元軸突的方法，為研究軸突損傷后線粒體穩(wěn)態(tài)與能量代謝的分子調(diào)控機(jī)制提供了有力的研究工具。

近日，美國國立衛(wèi)生研究院盛祖杭課題組在Cell Regeneration上發(fā)表了題為“Microfluidic devices as model platforms of CNS injury-ischemia to study axonal regeneration by regulating mitochondrial transport and bioenergetic metabolism”的方法論文章。該研究主要通過結(jié)合微流控芯片裝置與活細(xì)胞動態(tài)觀察技術(shù)，為研究中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后軸突內(nèi)線粒體運(yùn)輸、能量代謝、蛋白質(zhì)合成等細(xì)胞生物學(xué)事件提供了新的研究方法。

首先，研究人員參考Taylor等人的報(bào)道設(shè)計(jì)微流控芯片，并利用該裝置將體外培養(yǎng)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元的軸突與胞體和樹突分離。隨后，使用機(jī)械損傷、低糖低氧等方法模擬體內(nèi)軸突損傷和腦卒中等急性應(yīng)激，觀察神經(jīng)元軸突急性損傷后退化和再生的過程。與之前在動物模型中的研究一致，成熟的中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元在受到急性損傷后出現(xiàn)明顯的軸突退化、再生失敗等表型。

使用微流控芯片建立神經(jīng)元損傷與低糖低氧模型

接著，使用熒光探針GO-ATeam2實(shí)時(shí)指示神經(jīng)元中的ATP水平后發(fā)現(xiàn)，軸突損傷和低糖低氧狀態(tài)下，軸漿、軸突末端、神經(jīng)元胞體的ATP水平呈現(xiàn)出不同的變化趨勢和應(yīng)答時(shí)序。使用熒光蛋白標(biāo)記軸突線粒體后發(fā)現(xiàn)，軸突損傷阻斷軸突線粒體的雙向運(yùn)輸，并且在損傷12小時(shí)后難于恢復(fù)；而低糖低氧刺激后，軸突線粒體的逆向運(yùn)輸相比于正向運(yùn)輸表現(xiàn)出明顯的回復(fù)趨勢，暗示著神經(jīng)元在兩種應(yīng)激之間不同的分子應(yīng)答機(jī)制。

使用ATP探針Go-ATeam2檢測神經(jīng)元不同損傷后能量代謝的動態(tài)變化

最后，利用嘌呤霉素-近端標(biāo)記技術(shù)對軸突中特異蛋白的合成進(jìn)行了原位檢測。結(jié)果顯示在低氧低糖狀態(tài)下，線粒體激酶PAK5在軸突中的蛋白合成水平明顯增高，8小時(shí)后逐漸恢復(fù)，而線粒體蛋白Miro-1在軸突中的蛋白合成水平?jīng)]有顯著變化。

使用Puro-PLA技術(shù)原位監(jiān)測神經(jīng)元損傷后軸突中蛋白合成的動態(tài)變化

綜上所述，與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的體內(nèi)損傷模型相比，借助微流控芯片裝置建立的體外損傷模型易于實(shí)現(xiàn)、重復(fù)性高，并且可以結(jié)合活細(xì)胞成像實(shí)時(shí)觀察受損神經(jīng)元中的動態(tài)變化。通過高內(nèi)涵成像技術(shù)，損傷軸突中的線粒體運(yùn)輸以及能量代謝可以作為神經(jīng)損傷修復(fù)相關(guān)藥物篩選的重要指標(biāo)。

審核編輯：郭婷