液體活檢是確定癌癥發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵性技術(shù)，有助于提前預(yù)防癌癥的發(fā)生或轉(zhuǎn)移。基于細(xì)胞外囊泡（EV）的液體活檢已經(jīng)成為癌癥檢測(cè)中的新興技術(shù)。然而，其應(yīng)用存在眾多障礙，如無(wú)法有效收集足夠EV用于分析生物學(xué)功能的變化，無(wú)法有效定性其源組織。此外，由于缺乏有效的生物標(biāo)記物，EV的分離技術(shù)也有所受限。如果能夠提升基于EV的腫瘤檢測(cè)性能，將有效解決臨床中腫瘤的早期篩查等困難。

基于此，來(lái)自加拿大瑞爾森大學(xué)（Ryerson University）的譚波教授團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)了一種納米工程化的3D傳感器，由納米尺度探針實(shí)現(xiàn)自功能化的表面增強(qiáng)拉曼散射（SERS）技術(shù)，對(duì)三種難以檢測(cè)的癌癥——乳腺癌、肺癌和結(jié)直腸癌具有100%的敏感性和100%的特異性，能夠準(zhǔn)確的將癌癥與非癌癥樣本區(qū)分開(kāi)來(lái)。相關(guān)工作以“Cancer Stem Cell Derived Extracellular Vesicles with Self-Functionalized 3D Nanosensor for Real-Time Cancer Diagnosis: Eliminating the Roadblocks in Liquid Biopsy”為題于近期發(fā)表在ACS Nano期刊。

圖1 3D納米傳感器的構(gòu)造及其用于癌癥的檢測(cè)

研究人員利用超快飛秒激光的多光子電離機(jī)制制備了納米傳感器。通過(guò)將鈦樣品暴露在離子輻射下，生成自組裝的納米探針網(wǎng)絡(luò)，制備了三種類型的納米傳感器。通過(guò)控制激光刻蝕深度和激光脈沖的峰值功率來(lái)控制納米傳感器的特性，并進(jìn)一步用分析物（羅丹明6G；R6G）測(cè)試納米傳感器的SERS信號(hào)放大效率。R6G的SERS光譜顯示了顯著增強(qiáng)的特征峰。相比沒(méi)有納米傳感器的R6G，納米傳感器1上的R6G的增強(qiáng)程度最高（約1000倍）。使用FDTD模擬求解麥克斯韋方程在鈦基納米探針周?chē)膮^(qū)域。散射光強(qiáng)度的增強(qiáng)與電場(chǎng)增強(qiáng)的四次冪成正比，場(chǎng)增強(qiáng)的存在產(chǎn)生了局域表面等離子體。此外，研究人員使用了三個(gè)激發(fā)波長(zhǎng)分析了電荷轉(zhuǎn)移機(jī)制的影響及其對(duì)波長(zhǎng)的依賴。R6G的非完全對(duì)稱模式在三個(gè)激發(fā)波長(zhǎng)上的選擇性放大證實(shí)了電荷轉(zhuǎn)移的存在。鈦的折射率為~2.61，TiO?的折射率為~2.1，空氣的折射率為1.61。三種材料折射率的對(duì)比可以產(chǎn)生全內(nèi)反射，除了在多層功能化納米探針中捕獲光子外，這還大大增強(qiáng)了拉曼信號(hào)隨著氧空位的存在，整體SERS水平顯著提高。與低氧空位的傳感器（納米傳感器2和3）相比，具有最高氧空位的納米傳感器（納米傳感器1）有效提高了約1000倍的SERS。此外，氧空位可以豐富表面態(tài)，放大分析物和表面相互作用，一定程度誘導(dǎo)癌癥納米傳感器的拉曼信號(hào)顯著改善。

圖2 基于腫瘤納米探針的SERS技術(shù)。

（A）納米傳感器對(duì)羅丹明6G的SERS光譜顯示，其拉曼信號(hào)增強(qiáng)高達(dá)1000倍。與其他傳感器相比，最小尺寸和最高氧空位的納米傳感器（納米傳感器1）表現(xiàn)出最高的信號(hào)增強(qiáng)。（B）納米傳感器平臺(tái)上羅丹明6G的示意圖。（C）顯著增強(qiáng)信號(hào)歸因于多種現(xiàn)象的激活：（i）FDTD模擬表明存在SPR；（ii）極小尺寸相關(guān)的電荷轉(zhuǎn)移機(jī)制和氧空位的存在是納米傳感器顯著SERS響應(yīng)的原因；（iii）由于納米傳感器三維網(wǎng)絡(luò)的存在而產(chǎn)生的內(nèi)部全反射。

研究人員對(duì)來(lái)自三種乳腺、肺和結(jié)腸CSC的EV進(jìn)行納米傳感器輔助SERS譜分析。PCA結(jié)果顯示PC評(píng)分存在顯著差異。PC1、PC2和PC3演示了三個(gè)單獨(dú)的簇。特征峰強(qiáng)度被繪制在熱圖中，以可視化觀察EVs內(nèi)容物的差異。然后將PCA得到的特征（拉曼峰）應(yīng)用于未經(jīng)處理的患者等離子體光譜，進(jìn)行了兩種類型的分析。

首先，將一個(gè)組織起源與所有其他起源進(jìn)行分類?；贏NN的分類具有100%的敏感性、100%的特異性、100%的準(zhǔn)確性和100%的精度。同時(shí)，對(duì)乳腺癌達(dá)到了100%的敏感性和68%的特異性；結(jié)直腸癌的敏感性為36%，特異性為100%；肺癌的敏感性為99%，特異性為100%。觀察到大腸癌患者的血漿與乳腺癌有非常高的相似性。

因此，對(duì)于大腸癌，二分分類會(huì)更合適。這些結(jié)果表明，納米傳感器的能力可以準(zhǔn)確識(shí)別組織來(lái)源。為了證實(shí)CSC EV對(duì)起源組織檢測(cè)的適用性，研究人員利用PLSDA建立的訓(xùn)練模型進(jìn)行補(bǔ)充分析，實(shí)現(xiàn)了73%的乳腺癌敏感性，42%的大腸癌敏感性和100%的肺癌診斷敏感性。乳腺癌的特異性為88%，大腸癌的特異性為100%，肺癌的特異性為70%。

圖3 CSC EV鑒定源組織。

（A）乳腺癌信號(hào)來(lái)自于乳腺CSC EV的拉曼譜。（B）從結(jié)直腸癌CSC EV的拉曼譜獲得的結(jié)直腸癌信號(hào)。（C）肺癌的信號(hào)來(lái)自肺CSC的EV的拉曼譜。（D）乳腺癌、肺癌和結(jié)直腸癌的CSC EVs PCA顯示CSC EVs聚類，源組織鑒定示意圖。（E）將PCA特征應(yīng)用于患者血漿樣本。起源組織與所有其他組織的二元分類達(dá)到了100%的準(zhǔn)確性。同時(shí)多類分類準(zhǔn)確率達(dá)79%。（F）采用PLSDA分析對(duì)方法學(xué)進(jìn)行驗(yàn)證，證明診斷具有很高的敏感性和特異性。

總而言之，由于一些生物學(xué)和技術(shù)上的挑戰(zhàn)，例如無(wú)法同時(shí)獲得EV內(nèi)多個(gè)分子的分子信息，現(xiàn)有的基于EV的液體活檢臨床可用性非常有限。

此外，現(xiàn)有的EV液體活檢不能識(shí)別組織的起源。研究人員通過(guò)對(duì)CSC EV的分子和功能信息的研究，消除了現(xiàn)有液體活檢的局限性。采用這種液體活檢工具，可以提高EV傳感器相互作用效率，可同時(shí)檢測(cè)多個(gè)EV的信號(hào)，通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明了CSC EV信號(hào)的利用對(duì)液體活檢是至關(guān)重要的。

對(duì)于三種難以檢測(cè)的癌癥（乳腺癌、肺癌和結(jié)直腸癌），人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)以100%的敏感性和100%的特異性區(qū)分癌癥和非癌癥?；贏NN的二元分類將一個(gè)組織的起源與所有其他組織區(qū)分準(zhǔn)確率100%，同時(shí)對(duì)所有三種不同類型的組織來(lái)源進(jìn)行鑒定，患者血漿樣本的準(zhǔn)確率達(dá)到79%。證明了技術(shù)的臨床可用性。如果在未來(lái)得到大量臨床樣本的驗(yàn)證，這種模式可能會(huì)作為一種無(wú)創(chuàng)工具來(lái)補(bǔ)充現(xiàn)有的診斷工作流程以及縱向治療監(jiān)測(cè)。



審核編輯：劉清