腫瘤干細(xì)胞（CSCs）是癌癥復(fù)發(fā)、惡化和無(wú)效治療的主要原因之一。免疫檢查點(diǎn)療法是目前腫瘤治療中潛力較大的一種治療策略，如抗程序性死亡-1抗體（aPD-1）的免疫治療已經(jīng)在多種腫瘤治療中發(fā)揮抑瘤的作用。但是，整體的治療效果往往受到CSCs免疫逃避的限制?？笴SCs的治療將有助于提升癌癥的整體治療效果，改善目前臨床中免疫檢查點(diǎn)療法的局限。

基于此，廣州醫(yī)科大學(xué)謝茂彬教授團(tuán)隊(duì)研制了一種集協(xié)同免疫和氫治療于一體的可穿戴絲質(zhì)微針裝置（SMND），由雙層MN貼片（DLMNP）組成，以載aPD-1的絲素蛋白（SF）為內(nèi)基質(zhì)，以載氨硼烷的介孔二氧化硅納米顆粒（AB-MSN）包覆聚己內(nèi)酯為外熱響應(yīng)涂層進(jìn)行H?釋放。結(jié)果顯示該協(xié)同治療策略可實(shí)現(xiàn)令人滿意的抗腫瘤和抗CSCs療效，同時(shí)全身毒性最小。相關(guān)工作以“A Smart Silk-Based Microneedle for Cancer Stem Cell Synergistic Immunity/Hydrogen Therapy”為題于2022年7月18日發(fā)表在Advanced Functional Materials期刊。

圖1 SMND制備與智能給藥原理圖。a）無(wú)線連接SMND經(jīng)皮給藥小鼠黑色素瘤模型示意圖。b）負(fù)載雙藥的DLMNP的結(jié)構(gòu)。c）AB-MSN的制備方法示意圖及酸觸發(fā)分解和H?釋放機(jī)理。d）智能手機(jī)控制SMND的智能熱響應(yīng)藥物釋放示意圖。e）SMND抗CSCs協(xié)同免疫/氫治療機(jī)制示意圖。

研究人員開(kāi)發(fā)的SMND體積小巧、重量輕，由于其可彎曲性和手腕帶的靈活性，可以包裹在患者的手腕上。加熱膜與FPCB電連接，粘在DLMNP背面。FPCB尺寸為50mm × 25mm，重量較輕，只有24g。此外，SMND的加熱膜是微型的，直徑為10mm，厚度為0.5mm。采用微成型技術(shù)在PDMS母模上制備了該貼片的DLMNP。光學(xué)顯微鏡表征了DLMNP的結(jié)構(gòu)和形態(tài)。每個(gè)金字塔MN都整齊地排列成15 × 15方陣，中心距離為1500μm。每個(gè)MN的平均高度為600μm，頂端直徑為20μm，底部直徑為200μm。羅丹明6G作為模型藥物，包裹在DLMNP中。結(jié)果表明，羅丹明6G可以在MN中均勻荷載。使用定制開(kāi)發(fā)的智能手機(jī)APP進(jìn)行SMND在實(shí)際應(yīng)用場(chǎng)景下的調(diào)試。首先點(diǎn)擊APP圖標(biāo)進(jìn)入APP界面。整個(gè)界面分為搜索藍(lán)牙按鈕、加熱按鈕、停止加熱按鈕三個(gè)功能按鈕，以及藍(lán)牙信息顯示窗口和實(shí)時(shí)溫度顯示窗口兩個(gè)顯示窗口。然后，點(diǎn)擊SEARCH面板，找到目標(biāo)藍(lán)牙BT16。最后，在藍(lán)牙信息顯示窗口點(diǎn)擊BT16，即可成功連接智能手機(jī)與FPCB的藍(lán)牙連接。同時(shí)，F(xiàn)PCB中的紅燈會(huì)亮起來(lái)，表示連接成功。然后點(diǎn)擊HEAT面板，觸發(fā)加熱膜的加熱功能。同時(shí)，可以實(shí)時(shí)顯示溫度，并伴有燈圖標(biāo)的顏色變化。一旦溫度達(dá)到50攝氏度，它就會(huì)保持這個(gè)溫度。點(diǎn)擊STOP按鈕后，溫度會(huì)逐漸下降。因此，可以通過(guò)APP指令HEAT/STOP啟動(dòng)熱膜熱驅(qū)動(dòng)和熱控制。

圖2 SMND的電子和物理結(jié)構(gòu)。a）腕帶下SMND與FPCB組裝的光學(xué)圖像。b）FPCB上詳細(xì)塊電路的光學(xué)圖像。c）與FPCB電連接的柔性加熱膜的光學(xué)圖像。d）DLMNP的數(shù)碼照片。e）羅丹明6G染色DLMNP及其平臺(tái)的數(shù)字顯微鏡圖像（f）和側(cè)視圖（g）。h）定制智能手機(jī)APP加熱控制和數(shù)據(jù)顯示的實(shí)時(shí)操作：（步驟1）點(diǎn)擊桌面圖標(biāo)進(jìn)入APP；（步驟2）點(diǎn)擊SEARCH面板查找目標(biāo)藍(lán)牙名稱；（步驟3）選擇目標(biāo)藍(lán)牙BT16進(jìn)行連接；（步驟4）點(diǎn)擊所述HEAT面板，對(duì)所述柔性電路進(jìn)行加熱控制；（步驟5）點(diǎn)擊停止面板，停止加熱。

DLMNP由SF基內(nèi)層MN和PCL基外層組成。DLMNP的表面是白色的，而不是像內(nèi)部SF MN那樣透明的。在噴涂前后，除表面外觀外，DLMNP的形狀和結(jié)構(gòu)沒(méi)有變化。在DLMNP表面觀察到多孔和顆粒形態(tài)，同時(shí)內(nèi)SF MN表面相對(duì)光滑。此外，還引入了FITC標(biāo)記的PCL，并將Rhodamine 6G標(biāo)記的SF引入DLMNP制造過(guò)程，通過(guò)這兩種染料之間的發(fā)射波長(zhǎng)差異來(lái)幫助區(qū)分這兩種成分。顯然，在DLMNP的每一根針中都可以觀察到紅色和綠色的熒光，證明了整個(gè)DLMNP中兩種化合物的均勻整合。共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）圖像顯示了DLMNP的雙層結(jié)構(gòu)。采用乙醇蒸氣后處理來(lái)調(diào)節(jié)SF的二級(jí)結(jié)構(gòu)，以控制其溶出速率。通過(guò)FTIR和X射線衍射（XRD）揭示不同時(shí)間（0、2、4、6和8h）乙醇蒸汽處理SF MN內(nèi)部的構(gòu)象和二級(jí)結(jié)構(gòu)變化。未經(jīng)乙醇蒸汽處理的原始SF MN在1656/cm（酰胺I）、1537/cm（酰胺II）、1250/cm（酰胺III）處的紅外吸收峰相對(duì)較弱，在12.1處有一個(gè)典型的絲I晶體峰，具有典型的無(wú)規(guī)則線圈構(gòu)像和主要的非晶結(jié)構(gòu)特征，[26a,29]對(duì)應(yīng)著快速溶解的特征。然而，經(jīng)過(guò)乙醇蒸汽后處理的SF MN在1627/cm（酰胺I）、1525/cm（酰胺II）、1526/cm（酰胺II）和1230/cm（酰胺III）處出現(xiàn)了尖銳的吸收峰，以及顯著的典型絲狀I(lǐng)I晶體峰，在XRD中為20.2°、28.0°和30.9°，這是β-薄片構(gòu)像的代表。未處理的SF MN比后處理的SF MN在開(kāi)始時(shí)的藥物釋放率明顯更高。在28h內(nèi)，原始SF MN的累積藥物釋放量達(dá)94.1% ± 4.2%，而8h乙醇蒸汽后處理SF MN的累積釋藥量?jī)H為55.2% ± 3.3%。不同的乙醇蒸汽處理時(shí)間對(duì)SF MN后處理的釋放速率有影響。隨著乙醇蒸汽處理時(shí)間的增加，SF MN后處理藥物釋放速率減慢。力學(xué)試驗(yàn)中DLMNP的穿透力如圖所示，由于豬皮的固有阻力特性，力隨著載荷位移的增加而逐漸增大。隨著插入的進(jìn)行，可以清楚地觀察到P點(diǎn)插入力的一個(gè)小的突然下降。這表明DLMNP壓縮超過(guò)了皮膚破裂極限，導(dǎo)致皮膚穿透。因此，DLMNP的穿透力為0.58N，遠(yuǎn)小于破壞力1.78N。此外，對(duì)處理過(guò)的豬皮進(jìn)行了觀察，發(fā)現(xiàn)具有類似大小的DLMNP的陣列排列的紅色斑點(diǎn)，表明DLMNP確實(shí)在皮膚上產(chǎn)生了微孔。DLMNP擁有aPD-1加載的內(nèi)矩陣和AB-MSN封裝的PCL涂層。制備了熱響應(yīng)的PCL涂層，用于控制H?的釋放。PCL的熱相變特性賦予了DLMNP的熱反應(yīng)性能，可以通過(guò)探索封裝aPD-1的釋放來(lái)反映。DLMNP加熱15min（50℃），未涂覆MN組在228h內(nèi)累積釋放aPD-1為49.0% ± 2.4%，略高于未加熱的DLMNP組（33.19% ± 1.2%）。相反，加熱組的aPD-1釋放量在初始15min內(nèi)急劇增加，表明PCL在加熱到閾溫度后發(fā)生了由固態(tài)到液態(tài)的相變?？紤]到MN加熱導(dǎo)致aPD-1失活的風(fēng)險(xiǎn)，研究人員測(cè)試了aPD-1從DLMNP中釋放后的生物活性。據(jù)估計(jì)，釋放的aPD-1在4℃下儲(chǔ)存16天后，90%以上的aPD-1仍然具有與PD-1抗原結(jié)合的生物活性。同樣，PCL在DLMNP中的熱相變特性可以通過(guò)H?的釋放反映。只有當(dāng)溫度達(dá)到50℃（PCL的相變溫度）時(shí)才能生成H?，這進(jìn)一步說(shuō)明了DLMNP的熱響應(yīng)能力。

圖3 DLMNP的理化特性。a）未涂PCL的DLMNP的數(shù)字顯微鏡圖像。b）未涂PCL的DLMNP的SEM圖像：b（i）單個(gè)MN；b（ii）MN的上尖端；b（iii）MN的主體；b（iv）MN的表面。c）PCL涂層DLMNP的數(shù)字顯微鏡圖像。d）DLMNP的SEM圖像：d（i）單個(gè)MN；d（ii）MN上尖；d（iii）MN體；d（iv）MN表面。e）DLMNP的熒光圖像：外層包埋FITC（綠色），內(nèi)部MN包埋羅丹明6G（紅色）；e（ii）它們的重疊部分（黃色）。f和f（i）不同視圖下DLMNP的三維共焦重建圖像。g-i）不同時(shí)間（0、2、4、6、8h）乙醇蒸氣處理DLMNP內(nèi)SF MN的理化特征：（g）SF MN的FTIR；（h）SF MN的XRD；（i）SF MN的溶解譜。j）DLMNP的機(jī)械穿透曲線和j（i）經(jīng)DLMNP處理的皮膚樣本圖片。k）隨著時(shí)間的推移，在37℃ PBS（pH=7.4）中培養(yǎng)的DLMNP體外積累aPD-1釋放。l）aPD-1從DLMNP釋放后的生物活性。

為了評(píng)價(jià)SMND的體內(nèi)抗癌和抗CSCs效率，研究人員采用B16F10-CSCs荷瘤小鼠模型模擬臨床轉(zhuǎn)移性黑色素瘤。注射aPD-1的小鼠在最初的8天內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)延遲，而隨后腫瘤明顯復(fù)發(fā)，在AB-MSN組也發(fā)現(xiàn)了類似的趨勢(shì)。DLMNP聯(lián)合AB-MSN組和DLMNP聯(lián)合aPD-1組腫瘤消退作用有限，腫瘤復(fù)發(fā)是由于CSCs的異質(zhì)性導(dǎo)致的免疫耐受所致。相反，經(jīng)aPD-1 + AB-MSN治療的DLMNP小鼠表現(xiàn)出持續(xù)的腫瘤抑制作用，一些腫瘤在治療后甚至消失。14天后，經(jīng)aPD-1 + AB-MSN治療的DLMNP小鼠的腫瘤重量（39.8 ± 21.5mg）遠(yuǎn)小于經(jīng)AB-MSN治療的DLMNP（671.6 ± 24.7mg）和經(jīng)aPD-1治療的DLMNP（601.4 ± 31.7mg）。血紅素和伊紅（H&E）染色圖像顯示，在aPD-1 + AB-MSN的DLMNP治療的動(dòng)物模型的大部分腫瘤區(qū)域出現(xiàn)廣泛的組織病理學(xué)和壞死。結(jié)果表明，免疫治療和氫治療的協(xié)同抗腫瘤作用比單一治療更有效。不同處理后未觀察到明顯的體重、減輕或其他臨床毒性跡象，這表明DLMNP聯(lián)合aPD-1 + AB-MSN治療可能是一種安全的治療策略，具有很大的臨床潛力。為了進(jìn)一步證實(shí)DLMNP在腫瘤部位的持續(xù)釋放aPD-1，研究人員在不同時(shí)間點(diǎn)收集治療過(guò)的腫瘤進(jìn)行免疫染色。aPD-1組在給藥日（第0天）腫瘤部位出現(xiàn)較強(qiáng)的抗體信號(hào)。DLMNP傳遞的aPD-1在3天內(nèi)產(chǎn)生連續(xù)信號(hào)，具有持續(xù)免疫治療的潛力，并極大地避免了重復(fù)穿刺以保持足夠的藥物濃度。

圖4 SMND的體內(nèi)協(xié)同抗癌效率。a）小鼠背側(cè)及相關(guān)皮膚（紅圈內(nèi)區(qū)域）經(jīng)皮注射SMND的DLMNP。b）對(duì)B16F10-CSCs小鼠模型進(jìn)行不同處理的示意圖。c）小鼠治療后腫瘤的代表性照片。d）腫瘤生長(zhǎng)曲線和e）B16-CSCs荷瘤小鼠在治療14天后的腫瘤重量。f）治療14d后切除腫瘤代表性H&E染色圖像。g）B16 CSCs荷瘤小鼠治療14天內(nèi)體重。h）不同時(shí)間點(diǎn)aPD-1處理腫瘤和aPD-1 + AB-MSN處理DLMNP的免疫熒光染色（綠色：aPD-1；藍(lán)色：細(xì)胞核）。i）熒光圖像分析的平均熒光強(qiáng)度。

綜上所述，研究人員開(kāi)發(fā)了一種可穿戴的蠶絲基微針裝置（SMND），用于智能給藥，并評(píng)估了其協(xié)同免疫和氫治療黑色素瘤CSCs的效果。SMND的雙層MN貼片（DLMNP）不僅可以實(shí)現(xiàn)熱響應(yīng)H?釋放，還可以實(shí)現(xiàn)aPD-1的持續(xù)傳遞，用于免疫治療。這種協(xié)同CSCs治療策略是雙重保險(xiǎn)。首先，H?的熱響應(yīng)釋放阻止了腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移。此外，其較強(qiáng)的穿透能力可以消除腫瘤內(nèi)部的CSCs，抑制CSCs的進(jìn)一步分化。其次，aPD-1的持續(xù)釋放阻斷腫瘤免疫逃逸。氫處理后存活的腫瘤細(xì)胞進(jìn)一步被T細(xì)胞捕獲，從而有效避免腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。最后，患者可以在家通過(guò)智能手機(jī)通過(guò)SMND的智能電子元件管理給藥過(guò)程，避免了醫(yī)護(hù)人員的護(hù)理需求。在B16F10-CSCs小鼠黑色素瘤模型中，協(xié)同治療實(shí)現(xiàn)了令人滿意的抗CSCs效果，同時(shí)全身毒性和副作用最小。

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https://doi.org/10.1002/adfm.202206406

審核編輯 ：李倩