尿路感染（Urinary tract infections，UTIs）是一種發(fā)病率和死亡率較高的感染性疾病，嚴(yán)重威脅人體健康和生命安全。尿路感染主要由大腸埃希菌（E.coli）引起，因而快速的病原學(xué)診斷對于合理使用抗生素和抑制細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生具有重要作用。

數(shù)字化核酸分析，如數(shù)字PCR技術(shù)，是一種基于大規(guī)模分散體系的絕對定量分析方法，具有不依賴標(biāo)準(zhǔn)品的絕對定量分析能力，然而，現(xiàn)有數(shù)字化核酸分析產(chǎn)品，通常采用離線式模式，這些設(shè)備普遍體積龐大，同時多步離線操作耗時較長，并且容易操作失誤和交叉污染，因而不適用于病原的現(xiàn)場快速檢測。

據(jù)麥姆斯咨詢報道，為了解決上述問題，來自華南理工大學(xué)及桂林電子科技大學(xué)的聯(lián)合研究團(tuán)隊(duì)建立了一種集成式微流控液滴數(shù)字化等溫擴(kuò)增（LAMP）方法，用于尿路感染細(xì)菌的快速檢測。相關(guān)研究成果以“集成式微流控液滴數(shù)字化等溫擴(kuò)增用于尿路感染細(xì)菌快速檢測”為題，發(fā)表在《分析化學(xué)》期刊。

芯片設(shè)計與制作

研究人員設(shè)計并制備了一種集成了核酸提取、液滴發(fā)生和數(shù)字化核酸分析的微流控芯片。芯片包含三層結(jié)構(gòu)（圖1A），共有4個核酸提取單元的微池，液滴發(fā)生單元的水相通道入口與核酸提取單元的LAMP預(yù)混液池底部對接，油相通道入口與儲油池底部對接。液滴收集池底部設(shè)置微柱陣列（直徑100μm，間距80μm），用于支撐芯片頂層。

圖1 芯片結(jié)構(gòu)及操作流程圖

（A）芯片由頂層、中間層和底層組成：頂層包含核酸提取單元的樣品池、洗滌液池、洗脫液池、預(yù)混液池以及滴液發(fā)生單元的儲油池，中間層包含液滴發(fā)生單元的液滴發(fā)生器和液滴收集池，底層為無結(jié)構(gòu)平板玻璃；（B）微流控芯片上的核酸提取與液滴發(fā)生：（a）將樣品混合液、洗滌液、洗脫液和LAMP混合液分別加載到指定的微池，（b）用磁力驅(qū)動磁珠分別進(jìn)入含有洗滌液和洗脫液的液滴，（c）通過往復(fù)轉(zhuǎn)移磁珠引發(fā)洗脫液液滴與LAMP混合液液滴融合，（d）注射器真空驅(qū)動液滴發(fā)生。

集成式微流控數(shù)字化核酸分析

核酸提取單元采用微流控序列液滴設(shè)計。程序化操控磁珠順序通過含有樣本/結(jié)合緩沖液、洗滌液和洗脫液的液滴，即可自動完成核酸-磁珠結(jié)合、核酸洗滌和洗脫。其后，拖動磁珠往返運(yùn)動，引發(fā)洗脫液液滴與反應(yīng)預(yù)混液液滴融合，即可構(gòu)成完整的等溫擴(kuò)增反應(yīng)體系。液滴發(fā)生單元使用注射器負(fù)壓驅(qū)動油相和水相進(jìn)入液滴發(fā)生器。十字型液滴發(fā)生器處，在油相剪切力作用下，水相被切割形成單分散液滴。為了調(diào)節(jié)水相流速，水相引入通道還設(shè)置了蜿蜒形的阻力調(diào)節(jié)器。

圖2 芯片核酸提取方法的優(yōu)化

（A）使用試劑盒提供的洗滌液提取核酸后的液滴LAMP；（B）使用酸化的1 × LAMP緩沖液作為洗滌液提取核酸后的液滴LAMP；（C）細(xì)菌裂解效率；（D）核酸回收效率。

液滴數(shù)字化LAMP

本研究采用濃度為8.835 × 10?CFU/mL的E.coli gDNA樣品進(jìn)行液滴LAMP，通過熒光成像分析確定陰性和陽性液滴的判定方法。如圖3B所示，當(dāng)以陰性液滴的平均熒光強(qiáng)度加3倍方差作為閾值時，獲得的陽性率（29.46%）最接近理論值（30.15%），因此確定其為陽性判定閾值。

圖3液滴數(shù)字化LAMP反應(yīng)條件的優(yōu)化

（A）加熱前后液滴體積變化情況；（B）陰陽性液滴區(qū)分閾值的判定，P代表陽性液滴，N代表陰性液滴；（C）EvaGreen核酸染料濃度的優(yōu)化；（D）BST聚合酶濃度和反應(yīng)時間的優(yōu)化。

集成式數(shù)字化LAMP用于細(xì)菌定量分析

集成式數(shù)字化LAMP的整個分析過程可在1.5h內(nèi)完成。采用集成式微流控芯片液滴數(shù)字化LAMP方法 E.coli ATCC25922菌懸液進(jìn)行了分析。由于液滴數(shù)字化LAMP的檢測靶標(biāo)為細(xì)菌gDNA，因而測得的核酸濃度等于細(xì)菌濃度（圖4）。由于數(shù)字化核酸分析技術(shù)對于病原菌的定量分析的精度高于定量培養(yǎng)法，并且引發(fā)尿路感染的細(xì)菌濃度范圍較寬，因而集成式數(shù)字化LAMP可滿足病原細(xì)菌定量檢測的要求。

圖4集成式微流控液滴數(shù)字化LAMP用于E.coli定量分析

（A）梯度濃度稀釋細(xì)菌樣本的液滴數(shù)字化LAMP結(jié)果；（B）液滴數(shù)字化LAMP測得的核酸濃度與平板計數(shù)測定的細(xì)菌濃度的線性相關(guān)性。

集成式微流控數(shù)字化LAMP用于尿路感染細(xì)菌檢測

利用建立的集成式微流控液滴數(shù)字化LAMP方法對13例E.coli尿路感染臨床樣本進(jìn)行了分析。本方法與傳統(tǒng)細(xì)菌平板計數(shù)法對于E.coli尿路感染的判定具有高度一致性。

綜上所述，研究人員建立了一種集成式微流控芯片液滴數(shù)字化等溫擴(kuò)增方法，可在同一芯片上完成基于液滴的核酸提取、樣本分散以及核酸等溫擴(kuò)增等過程，實(shí)現(xiàn)從樣品輸入到結(jié)果輸出的全流程檢測。采用模式樣本和實(shí)際臨床樣本的測試結(jié)果確認(rèn)了本方法的可靠性。本方法自動化程度高、操作簡便、定量分析精度高、分析速度快，適用于醫(yī)療資源有限條件下的感染性病原現(xiàn)場快速檢測。

論文鏈接：

https://doi.org/10.19756/j.issn.0253-3820.221085

審核編輯 ：李倩