新冠病毒（SARS-CoV-2）具有高度傳染性，目前的檢測(cè)均基于實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)技術(shù)，雖然效率高，但其技術(shù)要求高且價(jià)格昂貴，不適合資源相對(duì)稀缺的地區(qū)大規(guī)模使用。

據(jù)麥姆斯咨詢報(bào)道，江蘇省原子醫(yī)學(xué)研究所謝敏浩教授課題組基于CRISPR/Cas12a，開(kāi)發(fā)了一種穩(wěn)健且高靈敏度的電化學(xué)發(fā)光（ECL）生物傳感器平臺(tái)，用于檢測(cè)SARS-CoV-2 RdRp（RNA依賴性RNA聚合酶，簡(jiǎn)稱RdRP）基因。相關(guān)研究?jī)?nèi)容發(fā)表在Chemical Engineering Journal上。

為了構(gòu)建該生物傳感器平臺(tái)，研究人員在ECL生物傳感器電極表面修飾DNA四面體結(jié)構(gòu)，DNA四面體可以與DNA1形成DNA三鏈復(fù)合物，在核酸擴(kuò)增反應(yīng)的初始狀態(tài)下，引入兩個(gè)發(fā)夾DNA（H1和H2），在存在核酸外切酶III（Exo III）的情況下，可以同步切割、釋放H1a和H2a。只有當(dāng)H1a和H2a同時(shí)存在時(shí)，才能形成H1a/H2a雙鏈，從而激活CRISPR/Cas12a的活性，并允許CRISPR/Cas12a切割DNA1（圖1B）。如果反應(yīng)體系中不存在目標(biāo)物質(zhì)，則無(wú)法形成H1a/H2a雙鏈，也無(wú)法激活CRISPR/Cas12a的活性并切割DNA1。其中體系中的DNA1與電極表面的DNA四面體結(jié)合將引起ECL信號(hào)的變化，特別的是，該生物傳感器平臺(tái)可以在pH=10時(shí)“再生”（圖1A），使其能夠持續(xù)長(zhǎng)期使用，從而準(zhǔn)確監(jiān)測(cè)待測(cè)核酸濃度。

圖1 基于CRISPR/Cas12a反式活性測(cè)定SARS-CoV-2 RdRp基因的pH誘導(dǎo)再生生物傳感器示意圖

為了進(jìn)一步研究該傳感器平臺(tái)的特征，研究人員首先通過(guò)透射電子顯微鏡（TEM）對(duì)合成的Au-g-C?N?進(jìn)行表征，觀察到金納米粒子的直徑約為17nm，且均勻分散在C?N?納米片的表面（圖2A），此外還通過(guò)紫外表征發(fā)現(xiàn)合成的Au-g-C?N?將會(huì)在360nm和520nm之間有特征峰（圖2B），介于AuNPs（520nm）和g-C?N?（360nm）特征峰之間，并通過(guò)能量色散X射線光譜儀（EDX）進(jìn)行元素分析（圖2C、D），均表明Au-g-C?N?成功合成；通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）表征DNA四面體的成功合成（圖2E）。

圖2 Au-g-C?N?和DNA四面體的表征

在本研究中，發(fā)光信號(hào)最初來(lái)源于g-C?N?，其可能的發(fā)光機(jī)理如下：g-C?N?在外加電壓下獲得一個(gè)電子，并轉(zhuǎn)化為g-C?N?（1）；S?O?2?在外加電壓下獲得一個(gè)電子，并降低為SO?2?和SO??（2）；SO??和g-C?N??之間發(fā)生電子轉(zhuǎn)移，并且g-C?N??在激發(fā)態(tài)下變成g-C?N?*（3）；g-C?N?*的激發(fā)態(tài)完成了電子躍遷，并轉(zhuǎn)變?yōu)榛鶓B(tài)g-C?N?，同時(shí)在460nm處產(chǎn)生光（4）。

為進(jìn)一步表征pH介導(dǎo)再生生物傳感器逐步修飾過(guò)程的電化學(xué)響應(yīng)，研究人員采用了循環(huán)伏安法（CV）。裸玻碳（GCE）電極的CV曲線（曲線a）顯示了最大電流峰值。當(dāng)Au-g-C?N?（曲線b）沉積在電極表面時(shí)，電流峰值顯著降低。當(dāng)DNA四面體和6-巰基己醇（MCH）（曲線c）繼續(xù)在電極表面進(jìn)行進(jìn)一步修飾時(shí)，電流峰值繼續(xù)降低，表明不良導(dǎo)電物質(zhì)吸附在電極表面，這與DNA四面體和MCH的絕緣性能一致。DNA1繼續(xù)通過(guò)四面體吸附在電極表面后，電流繼續(xù)減少（曲線d），導(dǎo)致電流峰值出現(xiàn)類似的減少。同時(shí)，通過(guò)圖3B所示的電化學(xué)阻抗譜（EIS）對(duì)pH介導(dǎo)再生生物傳感器的逐步構(gòu)建過(guò)程進(jìn)行了表征。電化學(xué)CV和EIS表征均證明成功合成了pH介導(dǎo)再生生物傳感器。研究人員發(fā)現(xiàn)60min為Exo III輔助擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)間的最佳條件（圖3C），90min后三鏈核酸形成達(dá)到穩(wěn)定(圖3D)。

圖3 使用循環(huán)伏安法和電化學(xué)阻抗譜法表征生物傳感器的構(gòu)造

最終將構(gòu)建的比率ECL生物傳感器在優(yōu)化條件下用于檢測(cè)SARS-CoV-2 RdRp基因。圖4A描繪了ECL信號(hào)隨SARS-CoV-2 RdRp基因濃度增加的變化。發(fā)現(xiàn)ECL（620nm）/ECL（420nm）的變化值也與ECL（620nm）/ECL（420nm）呈線性關(guān)系（圖4B）：Y=6.466 × 10??X-0.034，R2=0.9950，其中Y是ECL（620nm）/ECL（420nm）的比值，X是RdRp基因的濃度，根據(jù)檢測(cè)極限（LOD）的計(jì)算公式：LOD=3σ/k，該生物傳感器的LOD為43.70aM。

圖4 不同靶標(biāo)DNA濃度下ECL及ECL（620nm）/ECL（420nm）信號(hào)的變化

將修飾后的電極浸入含有1pM SARS-CoV-2 RdRp基因的PBS中，連續(xù)掃描10個(gè)循環(huán)。ECL信號(hào)在460nm（圖5A）的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.7%，ECL信號(hào)穩(wěn)定在620nm（圖5B）時(shí)RSD為2.5%，這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明該生物傳感器具備優(yōu)異的穩(wěn)定性。最后，研究人員研究了構(gòu)建的生物傳感平臺(tái)在不同pH值下的pH介導(dǎo)再生。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)生物傳感器在TAE緩沖液（pH=10.0）中培養(yǎng)時(shí)，形成三鏈DNA的生物傳感器可以在該pH值下使得DNA從電極表面解離而再生（圖5D）。

圖5 pH誘導(dǎo)的再生生物傳感器的穩(wěn)定性和選擇性

總體來(lái)說(shuō)，謝敏浩教授課題組提出的基于CRISPR/Cas12a的pH介導(dǎo)再生生物傳感器，其用于診斷SARS-CoV-2 RdRp基因的檢測(cè)靈敏度可達(dá)到43.70aM，具有臨床應(yīng)用的潛力。

論文鏈接：

https://doi.org/10.1016/j.cej.2021.132472

審核編輯 ：李倩